GPC-1、miRNA-9及Caspase-3在肺腺癌中的表达及与病情和预后生存的相关性

智雅婧 冯铁虹 那顺孟和 郑媞

肺腺癌恶性程度高，是临床临床诊治困难的疾病之一。目前肺腺癌的发生及病程中相关分子机制的认识尚不够深入，因此寻找新的生物标志物对提高肺腺癌的诊断率，对改善患者预后意义重大。磷脂酰肌醇蛋白聚糖（glypicans，GPC）是一类由蛋白质、糖和脂质组成的复杂的复合物，有学者研究报道其与恶性肿瘤的发生、发展存在密切联系［1］。随着较多学者对微小RNA（microRNA，miRNA）的探究的，发现miRNA-9 在肿瘤的发生及发展中发挥重要作用［2］。有学者发现天冬氨酸特异性半肤氨酸蛋白酶（Cysteinyl Aspartatespecific Proteninases，Caspase）是细胞凋亡的中心环节，目前在哺乳动物中已发现14 种亚型［3］。本研究旨在探讨GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 在肺腺癌中的表达及与病情、预后生存的相关性，现研究报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2015年8月至2017年8月本院收治的76 份肺腺癌患者标本为观察组，其中男39 例，女37；平均年龄（60.51±3.57）岁；根据TNM 分期，可分为Ⅰ期～Ⅱ期33 例，Ⅲ～Ⅵ期43 例。选取上述患者远离3cm 的肺腺癌的癌旁正常组织76 分标本作为对照组。所有患者知情同意。整理并分析其临床资料。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本实验经医院伦理委员会批准同意。

纳入标准：①均经术后病理检查及术前影像检查确诊为肺腺癌［4］；②纳入研究前未接受过放、化疗等辅助治疗；③年龄在51～78 岁之间。排除标准：①合并其他恶性肿瘤及重要器官严重疾病者；②因精神障碍无法配合治疗者；③阿尔兹海默症者。

1.2 GPC-1、Caspase-3 检测方法

免疫组化法：标本经常规石蜡切片、脱水，加入酒精、自来水冲洗、显色、复染、脱水中性树胶封固。在显微镜下观察GPC-1、Caspase-3，检测过程严格按照说明进行，检测完成后由2 位高年资医师采用双盲法阅片。

1.3 miRNA-9 检测方法

取出组织标本置于新的EP 管家1 mLTrizol 裂解液。离心、取上清留取2 μL 用于RNA 质量检测，其余RNA 溶液放置-80℃冰箱备用。总RNA特异的茎环引物反转录按照反转录试剂盒说明书配置。采用逆转录-聚合酶链反应提取两组组织中的RNA，miRNA-9 序列：5′-GTTATCTAGCTGTATGAGTGCC-3′。样品做3 个平行孔，取其均数。相对表达量以2-ΔΔCt计算［5］。ΔΔCt=（Ct 目的基因-Ct管家基因）实验组-（Ct 目的基因-Ct 管家基因）对照组。

1.4 试剂选择

兔抗人GPC-1 多克隆抗体由北京博奥森生物技术公司提供；Caspase-3 鼠抗人单克隆抗体采购自美国Neo Markers 公司；miR-9mimics 及所用引物购自中国广州锐博生物科技有限公司。

1.5 结果判定

GPC-1、Caspase-3 阳性判断标准［6］：肿瘤细胞胞质或细胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒。阳性细胞占比：0 分（无阳性）；＜30.00%（1 分）；≥30.00%（2 分）。染色强度评分：0 分（无色）、1 分（淡黄色）、2 分（棕黄色）、3 分（棕褐色）。阳性细胞＜26%为1 分，阳性细胞占比26%～50%为2 分，阳性细胞占比51%～75%为3 分，阳性细胞＞75%为4 分；根据两者相乘结果进行评判：小于3 分（-）、3 分（+）、4 分（++）、5 分（+++）。阳性率=阳性例数/总例数×100%。miRNA-9 正常范围值：2.35～4.62 ng/mL［7］。

1.6 随访

本研究随访（患者自行来院复查）从患者术后开始，直至患者死亡或本研究的随访结束，为期3年，截止于2020年8月。患者的随访时间分布在1 至36 个月，平均随访时间为（20.10±2.64）个月。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行数据统计分析，计数资料用n（%）表示，采用χ2检验；绘制ROC 曲线，Kaplan-Meier 生存分析GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 表达对患者预后生存的影响，以tarone 法进行检验；影响患者预后的相关因素采用Logistic回归分析；以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 在不同组织中的表达

肺腺癌组织中GPC-1、Caspase-3 阳性表达及miRNA-9 高表达率高于癌旁正常组织（P＜0.05）。见表1，图1。

表1 GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 在不同组织中的表达［n（%）］Table 1 expression of GPC-1，mirna-9 and Caspase-3 in different tissues［n（%）］

图1 免疫组化染色图（×500）Figure 1 immunohistochemical staining（×500）

2.2 肺腺癌组织中GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3表达与患者病情进展的关系

GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 表达情况与肺腺癌患者年龄、性别、分化程度、肿瘤直径、血管侵犯无关（P＞0.05）。见表2。

表2 肺腺癌组织中GPC-1、miRNA-9、Caspase-3 表达与患者病情进展的关系Table 2 Relationship between the expression of GPC-1，mirna-9，Caspase-3 in lung adenocarcinoma and the progression of patients

2.3 肺腺癌患者不同GPC-1、miRNA-9及Caspase-3表达的预后情况

纳入的76 例肺腺癌患者3年生存率为35.53%（49/76），GPC-1 阳性表达、miRNA 高表达、Caspase-3 阴性表达的肺腺癌患者死亡率更高（P＜0.05）。见表3。

表3 肺腺癌患者不同GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 表达的预后情况［n（%）］Table 3 Prognosis of lung adenocarcinoma patients with different expression of GPC-1，mirna-9 and caspase-3［n（%）］

2.4 GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 表达与肺腺癌患者预后的关系

GPC-1 表达阴性及表达阳性中位生存时间分别为（36.01±2.26）个月、（30.22±1.71）个月；miRNA-9 高表达及低表达中位生存时间分别为（29.69±1.40）个月、（35.86±2.63）个月；Caspase-3 表达阴性及表达阳性中位生存时间分别为（27.42±1.66）个月、（34.51±1.96）个月。生存分析显示GPC-1（表达阴性）、miRNA-9（低表达）、Caspase-3（阳性表达）者生存期较长，Keplan-meier 生存曲线明显不同（P＜0.05）。见图2。

2.5 影响肺腺癌患者预后生存的单因素和多因素分析

图2 生存曲线Figure 2 survival curve

临床分期（Ⅲ～Ⅵ期）、有淋巴结转移、GPC-1 表达（阳性）、miRNA（高表达）及Caspase-3 表达（阴性）为影响肺腺癌患者预后生存的独立危险因素（P＜0.05）。见表4。

3 讨论

肺腺癌早期无典型症状，且尚无特异且敏感的标志物，绝大多数的患者无法及时确诊，因此耽误最佳治疗时机，即使患者得到手术根治，也需要面临高复发率和转移率的风险。如何提高肺腺癌的早期诊断率，改善预后为当前肺腺癌治疗亟待解决的难题。

国外研究发现［8］，GPC-1、Caspase-3 在肺腺癌组织中阳性表达率有较大差异，本研究发现在肺腺癌组织中GPC-1 阳性表达率、Caspase-3 阴性表达率、miRNA-9 高表达率均明显高于癌旁正常组织。考虑与纳入样本量不同有关，免疫组化抗原修复方式也存在差异，可能会导致研究结果存在一定偏差。

相关研究指出［9］，GPC-1 与肺腺癌相关，GPC-1阳性表达与肺腺癌淋巴结的侵袭和转移有关，其在肺腺癌发生过程中起到一定作用。本研究证实GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 的表达与TNM 分期、淋巴结转移有关。

表4 影响肺腺癌患者预后生存的单因素和多因素分析Table 4 univariate and multivariate analysis of prognostic factors in patients with lung adenocarcinoma

GPC-1 在生长发育和癌变过程中起关键作用，Xue F［10］等学者研究指出，GPC-1 在非癌组织中无表达或表达量极低，但在癌组织中呈高表达状态。Szychowski KA［11］等指出，GPC-1 在肝癌、胰腺癌等恶性疾病中阳性表达率较高。miRNA-9是是一种古老的小分子RNA，有较多研究发现其在乳腺癌、胃癌等肿瘤中呈异常表达，且参与了肿瘤的生长及转移，而由于肿瘤类型和下游作用靶点的不同miRNA-9 可作为促癌基因也可作为抑癌基因［12～13］。本研究发现miRNA-9 高表达中位生存时间明显短于miRNA-9 低表达者，提示其在肺腺癌中作为促癌基因发挥作用，促进了癌细胞的增值和扩散。Caspase-3 以低活性酶原形式广泛存在于细胞中，TNM 分期Ⅲ～Ⅵ的的肺腺癌患者Caspase-3 表达下调，可见Caspase-3 表达降低可能与参与肿瘤发生、发展的过程［14～15］。

本研究中肺腺癌患者3年生存率为仅35.53%，生存分析显示，生存分析显示GPC-1（表达阴性）、miRNA-9（低表达）、Caspase-3（阳性表达）者生存期较长，提示：GPC-1、miRNA-9 及Caspase-3 的异常表达与肺腺癌患者预后相关。经非条件多因素Logistic 回归模型进一步分析，再次肯定GPC-1、miRNA、Caspase-3 这三者在肺腺癌发生、发展及预后评估中的价值。但由于本研究本研究研究年限较短，且纳入样本量较少，研究结果难免存在偏倚，GPC-1、miRNA、Caspase-3 这三者联合检测是否有望成为更敏感且准确的指标仍有待研究。

综上所述，GPC-1、miRNA、Caspase-3 异常表达与肺腺癌患者病情进展密切相关，且不利于患者预后。提示临床工作者可通过加强监测这三项指标，以了解肺腺癌患者疾病进展情况，以评估患者预后。