柠檬苦素抑制乳腺癌细胞转移相关基因芯片分析

凌 珺， 刘伯霞， 李 涛， 陈 静

（1.宁夏医科大学基础医学院，银川 750004； 2.宁夏回族自治区生育力保持教育部重点实验室，银川 750004；3.宁夏医科大学总医院肿瘤外科，银川 750004）

乳腺癌严重威胁女性生命健康，具有恶性程度高、转移性强的特征[1-2]。现阶段针对乳腺癌的治疗方法常为手术治疗和药物治疗，因其副反应较为明显，近几年临床出现的靶向治疗[3]尤为重要。肿瘤转移是一系列连续的过程。恶性肿瘤的典型特征是肿瘤转移，其过程的发生不仅需要基质蛋白酶、细胞因子和多种黏附分子的参与[4-5]，还需要相关基因及信号转导机制等发生改变。有研究表明信号转导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在癌细胞的增殖、分化中起着关键的作用[6-8]。柑橘内含有的柠檬苦素对癌症可以起到很好的预防治疗效果[9-12]，且经过体外诱导凋亡等实验发现在多种人类肿瘤细胞系中（如乳腺癌、肺癌、骨肉瘤和结肠细胞等）均显示出相应的抗癌潜力[13-15]。

基因芯片技术现已成为研究人类疾病发生中分子机制的一个主要方法[16-17]。人们常选用基因芯片技术来分析肿瘤的分型从而确定临床下一步治疗方案及靶向药的选择[18]。基于此，本课题组希望利用生物信息学手段，通过分析经柠檬苦素作用后，乳腺癌细胞基因的改变，来寻找其发挥作用的分子机制及关键靶标，为柠檬苦素抑制乳腺癌细胞转移提供更充分的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器设备 二氧化碳培养箱（力康生物医疗科技控股有限公司）；4 ℃低温离心机（Eppendorf 公司）；ABI 9700 RCR 仪（ABI 公司）；全波长酶标仪、Nanodrop2000、GeneChipHybridization Oven 645、GeneChipFluidics Station 450、GeneChipScanner 30007G（Thermo Fisher公司）。

1.1.2 细胞、试剂与分组 三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231（美国Type Culture Collection 公司）。细胞用含有10%胎牛血清（MultiCell Technologies公司）的RPMI-1640 培养基（MultiCell Technologies 公司）并且在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。柠檬苦素20 mg（limonin）（上海融禾医药公司）。将乳腺癌MDA-MB-231 细胞株按照2×106的密度培养在直径为10 cm 培养皿中；待细胞贴壁后，分别用不同浓度的柠檬苦素（0、40、60 μM）进行处理，将收集的细胞分为对照组C（未经柠檬苦素处理的三个对照组C1、C2、C3）及6 个实验组T（经40 μM 柠檬苦素处理的三个实验组T1、T2、T3，经60 μM 柠檬苦素处理的三个实验组T4、T5、T6）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和总RNA 提取和纯化 细胞经柠檬苦素处理24 h，细胞贴壁程度达到85%～90%后，用PBS 进行清洗，随后加入TRIzol 反复吹打，待细胞充分裂解后，离心收集细胞。离心收集后的细胞室温静置5 min，使复合物充分分离。加入氯仿后，充分震荡15 s，静置3 min。4 ℃、12000 r·min-1离心10 min，吸取上清。加入异丙醇，上下充分颠倒混匀后，静止10 min，4 ℃、12000 r·min-1离心10 min，弃去上清，用75%乙醇洗涤沉淀，室温静置5 min 充分干燥后，加入DEPC 轻弹溶解RNA，55～60 ℃放置10 min，使RNA 充分溶解。-70 ℃进行保存。提取总RNA 浓度和质量采用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳测定，总RNA 纯化的详细步骤严格按照3’IVT PLUS Reagent Kit 操作。

1.2.2 数据标准化处理和差异基因（DEGs）的筛选 将样本处理后的基因数据集用Robust multi-chip average（RMA）进行统一性处理，通过R-package Combat 去除批次效应（batch effects）后，利用R 语言中的Limma 包初筛后得出差异基因[19-20]。以校正后的P＜0.01，|log2FC|＞1为筛选标准，得到不同柠檬苦素浓度处理后的实验组较对照组显著上调、下调的差异基因，并以对照组的基因芯片为验证集，考察所筛选出来的差异基因表达值与聚类区分度。根据样本类型和基因表达量，使用MEV4.9.0（multi experiment vie-wer）绘制基因聚类热图。

1.2.3 GO 功能注释和KEGG 富集分析 采用DAVID 6.8 数据库，通过GO 功能富集（gene ontology，GO）及KEGG 功能富集（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）对差异基因进行分析[21-22]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件对数据进行统计学分析，柠檬苦素药物处理组与对照组之间的差异采用t 检验。差异基因GO 功能注释和KEGG 富集采用超几何分布分析。实验结果用均数±标准差（±s）表示，P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异表达基因

初筛得到的差异基因中选择服从P＜0.01、|log2FC|＞1 标准的差异基因为此次研究的目的基因。在对照组及不同浓度柠檬苦素处理的实验组中，筛选出有表达差异的基因438 个，这些基因中包含81 个基因的表达显著上调和63 个基因的表达显著下调（差异均在2 倍以上）。聚类热图用于表示这些基因在对照组和不同浓度柠檬苦素干预的实验组中表达的情况。柠檬苦素抑制了STAT3 及大多数下游目标基因的表达水平，尤其人类1 型胰岛素样生长因子受体（the human type 1 insulin-like growth factor receptor，IGF-1R）、胰岛素样生长因2（insulin-like growth factor-2，IGF2）、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白1（Cyclic AMP response element-binding protein 1，CREB1）和真核细胞翻译起始因子4E（Eukaryotic translation Initiation Factor 4E，EIF4E）的表达呈现明显下调趋势，差异值在2 倍以上，见图1。

2.2 GO 富集分析和KEGG 富集分析

GO 分析显示，下调的DEGs 显著富集在生物学过程中包括跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、信号转导调控、对生长因子的反应等。在分子功能中下调的DEGs 富集于细胞运动的调节、细胞-底物黏附、细胞迁移的调控等，见图2。GO 细胞成分分析显示，下调的DEGs 富集于血管发育、维管系统发育、血管形态发生学、血管再生。同时在KEGG 通路富集分析结果发现，差异基因主要富集于血管生成途径、胰岛素受体信号传导途径和NF-κB 信号通路等，见图3。

3 讨论

目前基因芯片技术已用于临床肿瘤研究，尤其在乳腺癌的研究中有了极大的进展[23-25]，促进了乳腺癌的分子分型，推动了临床的靶向治疗。本研究通过基因芯片检测未经柠檬苦素处理的乳腺癌细胞和不同浓度柠檬苦素处理的乳腺癌细胞基因表达情况，共得到表达差异的基因438个，这些基因中包含81 个基因表达的上调和63个基因的表达下调。由于基因芯片是高通量的检测技术，其影响因素较多，难免出现假阳性。为了加强本次基因芯片结果的准确性，每组实验均独立重复3 次。

乳腺癌是发生在乳腺上皮组织最常见的恶性肿瘤[2]，其高发病率和病死率已成为危害世界女性生命健康的主要原因。目前，我国乳腺癌发病率和病死率也处于逐步上升的趋势，其中肿瘤转移是导致死亡的重要因素。乳腺癌的转移与其他肿瘤转移类似，都是一个复杂的生物学过程。在肿瘤转移的过程中，细胞转录因子STAT3 发挥着关键作用[26]。STAT3 发挥着调控细胞的增殖、侵袭、迁移和血管生成的作用，同时影响着肿瘤的生长和转移[27-28]。

柠檬苦素是柑橘的主要活性成分之一，现已被安全地用作营养和促进健康的膳食补充剂。虽然作为一类中草药单体化合物，但有研究[29]证实其具有的抗肿瘤作用，能够抑制肿瘤的生长。本研究通过设置对照组与不同浓度干预的实验组进行基因芯片表达谱差异分析，从中筛选出关键的差异基因，对差异基因进行功能注释和通路富集分析。从基因芯片分析的结果发现柠檬苦素抑制了乳腺癌转移相关大多数下游目标基因的表达水平，尤其是IGF2、IGF-1R、CREB1、EIF4E 的表达均呈现下调趋势。有研究报道[13，30-32]，IGF2、IGF-1R、CREB1、EIF4E 与乳腺癌的转移及其恶性进展过程密切相关。其中，IGF2 是肝脏分泌细胞中启到关键作用的基因。IGF2 在体内可以促进蛋白质的合成、DNA 的产生及新生血管的形成，同时还具有促进组织生长和分化的能力。IGF-1R 是一个类似胰岛素的受体，参与机体内多种过程，包括有丝分裂、细胞存活和分化。IGF2 的非调控表达和IGF-1R 信号网络的激活与肿瘤干细胞的增殖、存活和自我更新的维持有关。IGF2 可以通过激活IGF 信号通路，导致STAT3 磷酸化，激活下游靶因子，从而进一步达到促进肿瘤发生和发展的作用[33]。EIF4E 是蛋白质翻译的主要控制点，是真核起始因子4F（eukaryotic translation initiation factor 4F，EIF4F）复合物的一部分。当EIF4E 的翻译信号激活时就会促进肿瘤的发生[34]。CREB1 在人体中是一种重要的原癌基因，在不同信号通路与下游靶基因转录之间起中介作用。同时在cAMP/PKA 通路中，激活的CREB1 可以与启动因子上保守的cAMP 反应元件结合，在机体内发挥着促进细胞增殖分化和促进肿瘤的转移和发生的作用[35]。IGF-1R 及其下游转录因子STAT3/CREB1 信号的结构性和异常激活在肿瘤转移过程中起着至关重要的作用，活化的STAT3/CREB1 可能移位到细胞核内，调节侵袭相关靶基因和血管生成基因的表达，参与基底膜和细胞外基质的降解，促进癌细胞的转移和血管生成。因此猜测柠檬苦素可能通过抑制IGF2/IGFR1 介导的STAT3 信号通路的活性以及下调CREB1/EIF4E 相应靶基因的激活从而达到抗肿瘤转移的作用，本课题组将进一步进行深入探究。

本研究中，利用多种生物信息学方法多角度考察了对照组和经不同浓度柠檬苦素处理的实验组在基因表达及生物学过程之间的差异。从基因层面探索了柠檬苦素抑制乳腺癌转移的潜在靶点及通路，为抗肿瘤转移的治疗提供更好的方向。

综上所述，柠檬苦素及其结构衍生物可能是一类具有潜在低毒性的抗癌药物，其机制可能是部分通过IGF2/IGFR1 介导的STAT3 信号传导途径实现。