蛋白酶K预处理在SARS-CoV-2核酸提取中的应用探讨*

王 念，巫丽娟，周 易，宋兴勃，叶远馨，钟慧钰，周汶静，陶昕彤，刘堂喻亨，宋佳佳，斯艳君，陆小军，应斌武

四川大学华西医院实验医学科，四川成都 610041

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的迅速传播，已严重危害人类健康。早期实验室诊断可及时隔离新型冠状病毒肺炎(COVID-19)患者及其密切接触者，打破传播链[1-2]。同时，早期诊断和治疗可使患者有更好的结局[3]。大多数临床实验室采用实时荧光定量PCR(qPCR)对SARS-CoV-2进行核酸检测[4]。然而，SARS-CoV-2核酸检测的阳性率并不高。其中，核酸提取效率是影响其检出率的重要因素之一。因为蛋白酶K(PK)可对生物标本中的蛋白质进行消化，同时还可降解标本中的RNA核酸酶，阻止RNA被降解，对标本进行PK预处理可能会提高核酸的提取效率，从而降低其循环阈值(Ct值)，提高阳性检出率。因此，本文就核酸提取前预处理是否需要加入PK进行探讨。

1 材料与方法

1.1标本来源 选取本院2020年1月25日至6月30日临床上收集的COVID-19患者(根据SARS-CoV-2相关指南确诊)[4]的核酸阳性标本共70份，其中包括50份鼻咽拭子标本和20份粪便标本。

1.2仪器与试剂 鼻咽拭子含植绒拭子及3 mL保存液购自深圳海尔施生物医药股份有限公司；病毒RNA提取采用NucliSENS easyMAG磁珠提取系统(购自法国生物梅里埃公司)；PK试剂购自瑞士罗氏公司；SARS-CoV-2检测试剂购自湖南圣湘生物科技股份有限公司，采用SLAN-96P仪(购自上海宏石医疗科技有限公司)进行qPCR扩增。

1.3标本处理与提取 所有标本先经过56 ℃、30 min 灭活。 鼻咽拭子标本：取出标本后混匀保存液，分别取2份1 mL待测标本于1.5 mL小型离心管中，其中1份加入50 μL PK(20 mg/mL)，56 ℃下孵育30 min，另1份则直接在56 ℃下孵育30 min。粪便标本：取黄豆般大小的大便置于15 mL离心管中，加入3 mL生理盐水充分振荡混匀，1 000 r/min离心 5 min，分别取2份1 mL上清液于1.5 mL 小型离心管中，其中1份加入50 μL PK(20 mg/mL)，56 ℃下孵育30 min，另1份则直接在56 ℃下孵育30 min。所有标本的SARS-CoV-2核酸提取均采用NucliSENS easyMAG磁珠提取系统进行裂解、吸附和洗脱，洗脱体积为50 μL。

1.4标本扩增 根据试剂盒说明书对qPCR扩增体系进行配制，于qPCR仪上进行SARS-CoV-2的ORF基因和N基因扩增检测。扩增循环参数设定：反转录50 ℃ 30 min；cDNA预变性95 ℃ 1 min ；变性 95 ℃ 15 s；退火、延伸及荧光采集60 ℃ 30 s，45个循环。

1.5结果判读 首先，分析内标VIC通道是否有扩增曲线，且扩增产物的荧光信号是否达到设定的荧光阈值所对应的Ct≤40。然后，再分析FAM或ROX通道是否检测到典型的S型扩增曲线。若Ct≤40，则判定该结果为SARS-CoV-2核酸检测阳性；若FAM及ROX通道均未检测到典型的S型扩增曲线(未检测到Ct)，或Ct>40，则表示SARS-CoV-2核酸检测阴性。

2 结 果

2.1鼻咽拭子标本预处理的结果比较 在确诊SARS-CoV-2患者核酸阳性的50份鼻咽拭子标本中，结果显示，未处理组的ORF基因的Ct值为33.92±4.42，PK组的ORF基因的Ct值为34.21±3.99，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)；未处理组的N基因的Ct值为30.83±3.99，PK组的N基因的Ct值为31.12±4.31，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。因此，在使用NucliSENS easyMAG磁珠提取系统提取SARS-CoV-2核酸时，增加PK预处理步骤对鼻咽拭子标本的检测结果没有影响。见图1。

2.2粪便标本预处理的结果比较 在确诊SARS-CoV-2患者核酸阳性的20份粪便标本中，结果显示，未处理组的ORF基因的Ct值为31.37±5.90，PK组的ORF基因的Ct值为31.08±5.71，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)；未处理组的N基因的Ct值为27.74±3.47，PK组的N基因的Ct值为27.80±3.29，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。因此，在使用NucliSENS easyMAG磁珠提取系统提取SARS-CoV-2核酸时，增加PK预处理步骤对粪便标本的检测结果没有影响。见图2。

注：A为鼻咽拭子SARS-CoV-2标本ORF基因Ct值分散情况；B为鼻咽拭子SARS-CoV-2标本N基因Ct值分散情况；C为同一鼻咽拭子标本经两组平行实验后PCR扩增曲线图。

注：A为粪便SARS-CoV-2标本 ORF基因Ct值分散情况；B为粪便SARS-CoV-2标本N基因Ct值分散情况；C为同一粪便标本经两组平行实验后PCR扩增曲线图。

3 讨 论

SARS-CoV-2侵入人体宿主细胞是由细胞膜上血管紧张素转化酶2受体所介导，血管紧张素转化酶2受体广泛存在于呼吸道、口腔、回结肠等部位的上皮细胞中。呼吸道标本、消化道标本、血液标本均可作为实验室核酸检测的标本来源。由于COVID-19患者上呼吸道症状较弱，理论上下呼吸道标本(深部咳痰和气道抽取物)应作为核酸检测首选，但因多数患者咳痰困难，下呼吸道标本不易获得且存在较大的生物安全操作风险，故临床病原体标本主要以较易获得的鼻拭子或口咽拭子标本为主。因SARS-CoV-2可在人肠道上皮细胞进行感染复制，且有研究提出粪便中SARS-CoV-2核酸检出持续时间更长[5]。因此，粪便标本中病毒核酸检出率对于患者是否达到出院标准及是否存在传染性的判断具有重要意义。目前粪便也是主要的检测标本之一。因qPCR具有快速、简便、特异度高、灵敏度高、成本较低的特点，已成为SARS-CoV-2核酸检测的主要检测技术。目前，国内有上百家企业研发了SARS-CoV-2 qPCR检测试剂盒，其中有9个已经获得了国家药品监督管理局批准。在符合国家药品监督管理局批准程序的临床试验中，所有试剂盒与确诊病例标本的灵敏度均超过90%。然而，在实际的临床检测中，患者的阳性检出率并不高，阳性检出率仅为30%～50%[6-8]。影响核酸阳性检出率的因素较多，其中核酸提取效率是主要因素之一。

虽然，影响核酸提取效率的因素较多，但可以从多方面进行改进，从而提高核酸阳性检出率。标本提取前预处理是临床上提高核酸提取效率的常用方法，其中，利用PK进行预处理最为常见。而关于PK预处理是否可以提高核酸提取效率，国内外所做研究报道较多，但结论并不一致。如在KHELAIFIA等[9]对粪便标本中细菌DNA的提取一文中指出PK的预处理可提高DNA获得率，JIKUZONO等[10]指出PK预处理可提高用液基细胞溶液固定的甲状腺细胞的RNA回收率，但GOLDSCHMIDT等[11]则在对感染性病原体DNA提取的预处理一文中提出，在某些病原体的提取中，PK的预处理没有必要。而造成这些结论不一的原因可能有如下几点：(1)可能是PK性能存在一定差异；(2)可能是寄生虫、细菌、病毒等不同病原体(尤其是RNA病毒)对PK的预处理效果存在差异；(3)不同的标本类型及提取方法可能影响PK的预处理效果等。

在本研究的两组平行实验中，经PK预处理的50份含有细胞保存液的鼻咽拭子标本的核酸检测结果差异无统计学意义(P>0.05)，且在此次研究的20份粪便标本中，其结果与鼻咽拭子标本一致，PK的预处理在两组平行实验中差异无统计学意义(P>0.05)。JEDDI等[12]关于利用NucliSENS easyMAG磁珠提取系统对寄生虫病和真菌病DNA提取优化的分子诊断研究中，提出利用NucliSENS easyMAG系统进行核酸提取时，由于NucliSENS easyMAG磁珠提取系统中裂解缓冲液具有高解离活性，使PK消化在大多数情况下是可有可无的，与本研究结果相符。但有研究表明在对甲型流感病毒、中东呼吸综合征冠状病毒的痰液标本进行预处理的研究中，其研究结果均显示PK的预处理较其他预处理方法有较高的提取效率[13-14]。而导致这种结果差异的主要原因可能跟实验标本的类型不同有关。由于痰液标本中黏液丝的影响，标本可能不易裂解释放病原体，在操作过程中易导致取样不均，以及在进行磁珠提取时易堵塞枪头而无法进行自动提取进而造成结果的不准确。因此，在痰液标本中加入PK进行预处理尤为重要，可以提高RNA的提取效率。而在本研究中，大多数标本为含有保存液的鼻咽拭子标本，由于细胞保存液中缓冲剂的存在，能最大限度地保持细胞的完整性，并使之充分悬浮及分散，在使用NucliSENS easyMAG磁珠提取系统提取病原体时很容易释放核酸。因此，对鼻咽拭子标本进行PK预处理可能并不能提高其提取效率。而对于粪便标本，因本研究中粪便标本仅20份，其PK预处理的结论仍需大量标本进行验证。

目前对SARS-CoV-2检测方法的相关研究较少，其中仅有一篇文献[15]提到了PK预处理在“一步法”中的研究。而在实际情况下，因“一步法”检测阳性率较低，其仅用于提取试剂缺乏或一些紧急检测，在常规的SARS-CoV-2临床标本检测和筛查中，该方法已被禁止采用。而本研究则讨论PK预处理后，采用NucliSENS easyMAG磁珠提取系统对核酸提取效率的影响，具有一定的创新性。

本研究存在一定局限。首先，样本量有限，仍需扩大样本量进一步验证结论。本研究评估了鼻咽拭子标本和粪便标本，未对具有较高检出率的痰液标本进行研究，主要由于COVID-19患者上呼吸道症状较弱，痰液标本不易获得，且由于痰液标本中黏液丝的影响，可能导致研究过程中取样不均，从而影响研究结果的准确性。同时，PK预处理在不同提取方法中的影响也应考虑。

综上所述，在使用NucliSENS easyMAG磁珠提取系统对含有细胞保存液的SARS-CoV-2鼻咽拭子标本和粪便标本进行核酸提取时，对加PK和不加PK预处理的两组平行实验进行比较，PK的预处理对SARS-CoV-2的检测结果没有影响。因此，在使用NucliSENS easyMAG磁珠提取系统对SARS-CoV-2标本进行提取时，由于裂解缓冲液的高解离活性，可无需进行PK预处理，在一定程度上节省了时间和耗材。