膜联蛋白A2在神经胶质瘤中的表达及调控表型关键基因的生物信息学分析*

谢守嫔，颜伟姗，王 瑛，周迎霞，彭小兰，李海龙

甘肃省兰州市第一人民医院：1.神经科；2.感染管理科，甘肃兰州 730050；3.兰州大学第二医院放射影像科，甘肃兰州 730030；4.甘肃中医药大学第一临床医学院，甘肃兰州 730000

膜联蛋白A2(ANXA2)是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，在脊椎动物细胞中广泛表达。有研究表明，ANXA2在人神经胶质瘤等多种肿瘤细胞中异常高表达，且其表达与预后不良有关，是胶质瘤独立预后指标[1-4]。据报道，沉默ANXA2可抑制胶质瘤细胞株U251和U87的增殖，相反，上调ANXA2的表达可以促进U251细胞增殖[4]。沉默ANXA2可抑制信号传导与转录激活因子3和细胞周期蛋白D1的表达，将细胞周期阻滞在G1～S期[5]。研究表明，ANXA2参与恶性胶质瘤的血管生成、侵袭和转移[6-7]。ANXA2的泛素化和降解，S100钙结合蛋白A11(S100A11)与ANXA2相互作用，参与调节核因子κB(NF-κB)信号通路。此外，NF-κB在转录水平上正向调节S100A11，证明了S100A11在神经胶质瘤生长中的作用。为进一步明确ANXA2在神经胶质瘤中的表达及参与胶质瘤恶性表型形成的机制，本研究拟借助于生物信息学软件，分析ANXA2在神经胶质瘤中的表达、预后及其相关信号通路的分子机制。

1 资料与方法

1.1ANXA2基因在人胶质瘤及癌旁组织中的表达分析 选择基于癌症基因组图谱数据库的生物信息学分析软件开展ANXA2在胶质瘤及癌旁组织的表达分析，这些在线软件包括：UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)，ONCOMINE(https://www.oncomine.org/resource/login.html)和GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)。

1.2ANXA2基因在人胶质瘤组织异常表达的生存分析 利用在线分析网站Human protein atlas(https://www.proteinatlas.org/)对ANXA2基因分别在高表达和低表达胶质瘤患者中的临床样本进行无病生存期和总生存期分析。

1.3与ANXA2基因有相关性的基因信号通路富集分析 使用UALCAN软件检索与ANXA2基因有相关性的基因，其中表达上调的相关基因的相关系数(r)在0.30～0.99，表达下调的相关基因的r在-0.61～-0.30，并分别将上调和下调的基因全部输入DAVID 6.8软件(https://david.ncifcrf.gov/)进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析。

1.4与ANXA2有相关性的肿瘤基因蛋白互作(PPI)网络分析 选择在线STRING (https://string-db.org/)数据库，将34个与ANXA2有相关性的肿瘤基因输入在线软件STRING进行PPI网络分析。并观察节点，寻找节点最多的关键基因。

1.5与肿瘤有相关性的通路基因的表达情况及生存期分析 分析1.3中相关基因富集的信号通路，选择与肿瘤有相关性的信号通路，以及关键基因，利用GEPIA在线软件分析这些关键基因的表达对生存期的影响。

1.6统计学处理 富集分析结果的差异比较采用Fisher检验；PPI网络分析采用K-means聚类算法，以n=3进行聚类分析；生存分析方法采用Log-rank检验，检验水准α=0.05。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1ANXA2基因在人胶质瘤及癌旁组织中的表达 检索3个生物信息学分析软件UALCAN、GEPIA和ONCOMINE的结果表明，与癌旁组织比较，ANXA2基因在人胶质瘤组织中表达上调(P<0.05)，见图1。

注：A为UALCAN生物信息学分析软件基因相对表达水平；B为GEPIA生物信息学分析软件基因相对表达水平；C为ONCOMINE生物信息学分析软件作者SUN提供的mRNA相对表达水平；D为ONCOMINE生物信息学分析软件作者SHAI提供的mRNA相对表达水平。

2.2ANXA2基因在人胶质瘤及癌旁组织中的生存分析 采用Human protein atlas分析预后生存期显示，与ANXA2基因低表达组比较，胶质瘤中ANXA2基因高表达组生存期缩短，预后相对较差(P<0.05)。见图2。

2.3与ANXA2基因有相关性的基因的信号通路富集分析 通过UALCAN和DAVID 6.8软件分析发现，与ANXA2基因有相关性的上调基因共有1 396个，富集在35个信号通路中，其中与肿瘤有相关性的有10个，分别是Wnt信号通路、结直肠癌、cAMP信号通路、AMPK信号通路、细胞周期、ErbB信号通路、子宫内膜癌、慢性粒细胞白血病、癌症中的胆碱代谢、mTOR信号通路；与ANXA2基因有相关性的下调基因共有1 152个，富集在59个信号通路中，其中与肿瘤有相关性的有11个，分别是细胞因子受体相互作用、肿瘤坏死因子信号通路、局灶性粘连、细胞外受体相互作用、癌症中的蛋白多糖、NF-κB信号通路、NOD样受体信号通路、细胞黏附分子、细胞凋亡、Jak-STAT信号通路和MAPK信号通路，以上分析以富集倍数大于2的信号通路为筛选标准。见表1、2。

图2 ANXA2基因在人胶质瘤及癌旁组织中的生存分析

2.4PPI网络分析结果 筛选出与肿瘤有相关性的信号通路，再将34个基因富集在与肿瘤有相关性的信号通路中，进行PPI分析，并将其聚类在3个模块中。分析其节点，发现TNFRSF1A、ICAM1、TGFB1、ITGB5、ITGB1是节点最多的基因，由此提示，这5个基因在ANXA2基因调控胶质瘤的生物表型中发挥重要作用。

2.5与肿瘤有相关性的通路基因的表达情况及生存期分析 相关基因表达分析显示，与ANXA2表达有相关性的34个基因均为肿瘤组织中高表达的癌基因(P<0.05)。总生存期分析显示，THBS1、RRAS、OSMR、IL13RA1、COL6A1、PLAUR、SOCS3、ITGB5、TNFRSF1A、ITGA5、IQGAP1、HSPB1共12个基因的表达与总生存期相关(P<0.05)。无病生存期分析显示，TNFRSF12A、TGFB1、OSMR、LIF、ITGA5、ITGB5、TNC、THBS1、CACNA2D4、IL13RA1、COL6A1、CD276、ITGA3、CCL2、SOCS3共15个基因的表达与无病生存期相关(P<0.05)。其中，THBS1、OSMR、ITGA5、ITGB5、SOCS3、COL6A1、IL13RA1共7个基因的总生存期和无病生存期分析结果均显示，其基因的异常表达与预后关系密切。综合相关基因表达预后分析和PPI分析，除ICAM1和ITGB1外，TNFRSF1A、TGFB1和ITGB5均为与预后有相关性的基因。见表3。

表1 与ANXA2基因有相关性的上调基因富集的肿瘤相关信号通路

表2 与ANXA2基因有相关性的下调基因富集的肿瘤相关信号通路

表3 与肿瘤有相关性的通路基因的表达情况及生存期分析

3 讨 论

胶质瘤约占中枢神经系统原发恶性肿瘤的80%，世界卫生组织将胶质瘤分为Ⅰ～Ⅳ级，Ⅰ级和Ⅱ级属于低级别胶质瘤，Ⅲ级和Ⅳ级属于高级别胶质瘤，其恶性程度越来越高。每个等级的临床治疗和预后不同；但绝大部分胶质瘤是Ⅲ级的间变性胶质细胞瘤和Ⅳ级的胶质母细胞瘤，基本无法治愈[8-9]。近年来对神经胶质瘤的研究趋向于基因治疗学及分子生物学，发现某些细胞因子的表达能通过下游相关信号通路的变化，影响神经胶质瘤的恶性演变，加速或延缓病情的进展。因此，针对不同通路的靶向治疗也成了研究热点，随着研究的深入，从分子水平调控神经胶质瘤的发生、发展成为可能。

本研究基于生物信息学分析软件UALCAN、GEPIA和ONCOMINE的结果均显示，ANXA2基因在胶质瘤中是明显高表达的癌基因。与ANXA2基因有相关性的上调基因共有1 396个，富集在35个信号通路中，其中与肿瘤有相关性的有10个；与ANXA2基因有相关性的下调基因共有1 152个，富集在59个信号通路中，其中与肿瘤有相关性的有11个。ANXA2基因参与了细胞周期调控，这与邓正海等[5]的研究，在U251和U87胶质瘤细胞株中沉默ANXA2基因的表达，可以抑制细胞周期蛋白D1的表达，将细胞周期阻滞在G1～S期的结果一致。ANXA2基因参与NF-κB信号通路，这与文献[6-7]报道的ANXA2基因参与NF-κB信号通路介导的恶性胶质瘤血管生成、侵袭和转移的结果一致。因此，借助于生物信息学软件，明显有助于开展肿瘤标志物的表型和机制研究，能避免机制研究的盲目性。

PPI分析发现TNFRSF1A、ICAM1、TGFB1、ITGB5、ITGB1是节点最多的基因，这5个基因在ANXA2基因调控胶质瘤的生物表型中发挥重要作用，而且，综合相关基因表达预后分析和PPI分析，除ICAM1和ITGB1外，TNFRSF1A、TGFB1、ITGB5均为与预后有相关性的基因。这一结果为后期深入探讨分子机制，提供了思路和研究切入点。

使用Human protein atlas分析预后生存期显示，与ANXA2基因低表达组比较，ANXA2基因高表达组生存期缩短，预后相对较差。与肿瘤有相关性的信号通路的34个基因中，12个基因的表达与总生存期相关；15个基因的表达与无病生存期相关。ANXA2基因可能是胶质瘤中潜在的癌基因，与肿瘤有相关性并富集在20个信号通路中的基因的异常表达与胶质瘤预后明显相关。因此，ANXA2基因表达上调在胶质瘤中的发生、发展及预后过程中发挥重要作用，并有望成为判断胶质瘤患者预后的重要的肿瘤标志物。

近年来，采用生物信息学的方法，开展驱动基因、肿瘤标志物和信号通路的筛选，以及分子机制的研究，受到越来越多的关注，也越来越被学术界认可[10-15]，本研究主要从ANXA2基因表达水平改变、预后分析、参与的信号通路分析，以及高度相关基因的预后生存分析入手，对其基因的功能表型及调控胶质瘤进展的分子机制进行了生物信息学的研究和分析，结果对深入开展该基因调控胶质瘤表型的机制研究提供了依据，ANXA2基因有望成为胶质瘤诊断和治疗的生物学标志物。

综上所述，本研究借助于生物信息学软件和数据库分析后发现，ANXA2是胶质瘤中潜在的癌基因，筛选相关基因后进行信号通路富集分析，将获得的肿瘤相关信号通路基因进行生存期分析和PPI分析，最终发现TNFRSF1A、TGFB1、ITGB5是ANXA2参与胶质瘤发生、发展及预后的关键基因。