生育三烯酚抗骨质疏松症分子机制的研究进展

杨艳，彭雅茗，崔佳乐，林静，于澜，周广举

川北医学院附属医院，四川南充637000

骨质疏松症是多种原因引起的与年龄相关的一种全身性骨骼疾病，由于骨量下降和骨组织微结构破坏导致了骨骼脆性增加和骨折风险增大，即使轻微的创伤或无外伤的情况下也容易发生骨折［1］。我国是世界上老年人口最多的国家之一，预计到2050年我国骨质疏松症患者将达到1.2 亿［2］。随着全球人口老龄化问题日益突出，骨质疏松性骨折在55岁以上的女性和65岁以上的男性中越来越常见，且骨折风险的增高几乎累及全身所有部位的骨骼；骨折导致老年人生活质量下降，身心健康受损。骨质疏松症的传统药物治疗不良反应较明显，如激素替代疗法与心血管疾病和乳腺癌的风险增加相关，双膦酸盐可能引起下颌骨坏死，特立帕肽可能增加患骨肉瘤的风险［1，3］。目前对骨重塑更具特异性且不良反应较小的新型药物（如硬化蛋白抑制剂、组织蛋白酶K 抑制剂、靶向WNT 抑制剂等）研发虽然已经取得了很大进展［3-4］，但这些药物价格昂贵且疗效尚不确切。大量研究表明，生育三烯酚具有抗骨质疏松特性，现就其发挥作用的可能分子机制综述如下。

1 生育三烯酚与骨质疏松症

生育酚和生育三烯酚二者同属于维生素E 家族，根据侧链上的结构差异及母核上存在的甲基位置不同，每种同工型又可进一步分为α、β、γ、δ 四种亚型。在自然界中，玉米油和橄榄油中富含生育酚，其中α-生育酚是维生素E最主要的成分；米糠油、红棕榈油、大麦主要含生育三烯酚，其中红棕榈油维生素E 富含的生育三烯酚达75%，胭脂树种子更是富含90%的δ-生育三烯酚和10%的γ-生育三烯酚［5］。生育三烯酚具有抗氧化应激、抗炎、降胆固醇和抗肿瘤等多种生物活性。大量研究表明，生育三烯酚作为单一异构体或者混合物形式均显示出强大的抗骨质疏松特性，而生育酚在抗骨质疏松方面的相关研究结果则不一致。在骨质疏松动物模型中，生育三烯酚可预防和改善雌激素缺乏（卵巢切除术）、睾丸激素缺乏（睾丸切除术）、尼古丁、乙醇、糖皮质激素、代谢综合征、氧化应激、糖尿病等因素所致的骨质疏松［6-8］，此外，生育三烯酚也可促进正常大鼠骨形成。在骨重塑中，破骨细胞和成骨细胞的分解和重建有助于维持骨的质量和稳定性。骨重塑过程包含三个阶段，破骨细胞骨吸收激活，骨骼从分解代谢转换为合成代谢，成骨细胞修复新骨后终止［9］。骨重塑过程异常常导致代谢性骨病如骨质疏松症。生育三烯酚可通过抗氧化应激、抗炎、抑制甲羟戊酸途径、抑制破骨细胞分化、促进成骨相关基因的表达等多种途径影响骨重塑过程，从而保持骨骼的完整性。

2 生育三烯酚抗骨质疏松的分子机制

2.1 抗氧化、清除自由基 氧化应激是指机体组织或细胞内氧自由基增多且清除能力降低导致活性氧自由基（ROS）在体内或细胞内蓄积引起的氧化损伤过程。骨质疏松症形成的一个重要因素是负责合成骨基质的成骨细胞数量和活性下降以及成骨细胞中核因子-κB（NF-κB）配体受体激动剂的表达增加介导破骨细胞数量和活性增加所致，这在一定程度上与ROS 的产生增加超过体内生理量及抗氧化剂防御系统降低有关。过量的ROS 通过增加NF-κB 受体活化因子配体（RANKL）的产生和激活NF-κB 介导的炎症反应来促进破骨细胞生成并抑制其凋亡［10］。ROS 增多可引起叉头框蛋白O（FoxO）与Wnt通路竞争性结合β 连环蛋白（β-catenin）增强，从而将胞内有限的β-catenin 从T 细胞因子/淋巴细胞增强因子转录转移到FoxO 转录，导致成骨细胞的生成和增殖分化减少，降低骨形成［11］。另外，脂质过氧化作用的增强激活过氧化物酶增殖活化受体γ，导致骨髓间充质干细胞的成脂分化增强而成骨分化受到抑制［12］。生育三烯酚分子中含有不饱和双键，是一种脂溶性酚类抗氧化剂，可降低细胞ROS 水平，还可激活抗氧化酶和抵御氧化应激对成骨细胞的损害来提高成骨细胞的分化和活性。最近一项体外研究发现，δ-生育三烯酚对MC3T3-E1细胞氧化损伤的保护作用是通过降低细胞内ROS 水平和增加GSH/GSSG 比值实现的，此外该过程还与PI3K/Akt-Nrf2信号通路之间的相互作用有关［8］。有学者研究了不同浓度γ-生育三烯酚对暴露在过氧化氢中的成骨细胞脂质过氧化、抗氧化酶活性及细胞凋亡的影响，结果证实γ-生育三烯酚以浓度依赖方式防止丙二醛升高，增加了超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性，减少了成骨细胞凋亡，但高浓度会引起成骨细胞毒性，加速细胞凋亡［13］。此外，最新临床研究表明，在连续12 周补充生育三烯酚（430 mg/d 或860 mg/d）治疗的89 例绝经后骨质疏松症女性中，其骨吸收生物标志物如尿液N 端端肽（NTX）、血清可溶性RANKL（sRANKL）及sRANKL/骨保护素（OPG）比值，以及氧化应激的生物标记物如8-羟基2＇-脱氧鸟苷均明显降低，而血清特异性碱性磷酸酶/NTX 比率显著增加，骨吸收受到明显抑制［14］。

2.2 抑制炎症反应 既往研究表明，骨质疏松症和炎症密切相关，炎症是机体组织对损伤因子产生的一种防御反应，导致免疫细胞因子产生。炎症反应在消除受损骨组织和骨组织修复中起重要作用。但是，炎症反应的持续又会反过来抑制骨形成并激活骨吸收。炎症因子不仅可以刺激破骨细胞增殖和分化，还会进一步提高破骨细胞活性，加速骨基质降解，增加骨组织再吸收［6-7，15］。IL-1、IL-6、TNF-α 等炎症细胞因子均参与诱导破骨细胞生成［16］。TNF-α和IL-6在骨组织中与其特异性受体结合后引起成骨相关的基因表达下调，其部分是通过激活信号转导子和转录激活子抑制丝裂原激活的蛋白激酶活性以及通过泛素连接酶SMAD 泛素化调节因子1（SMURF1）和SMURF2 起作用的，部分是通过激活NF-κB 起作用；炎症细胞因子与其受体相互作用也会增加成骨细胞产生巨噬细胞集落刺激因子和RANKL，进一步促进破骨细胞分化、增殖和存活［17］；此外，促炎细胞因子还可上调Dickkopf 相关蛋白1和硬化蛋白，从而抑制成骨分化的关键途径即Wnt/β-catenin信号通路［17］。在破骨细胞前体细胞或破骨细胞中，TNF-α、IL-1、IL-6 通过NF-κB、MAPK 和Janus激酶-STAT 等信号通路发出信号，上调破骨细胞相关基因表达从而促进破骨细胞生成［17］。生育三烯酚具有抗炎活性，可以减少全身炎症反应而具有骨保护作用。研究发现，生育三烯酚处理可降低2 型糖尿病小鼠的炎性细胞因子（如IL-2、IL-23、TNF-α）水平，促进骨骼健康［6］；与对照组相比，生育三烯酚处理可明显降低代谢综合症引起的骨质疏松小鼠体内IL-1、IL-6、TNF-α的水平，表现为处理组的骨小梁微结构的得到明显改善［16］。尼古丁可刺激IL-1、IL-6 等细胞因子产生。在尼古丁诱发的骨质疏松模型中，破骨细胞数量增加，成骨细胞数量减少，骨形成速率降低，而补充生育三烯酚治疗后可逆转这种有害的骨骼改变［18］。还有研究发现，生育三烯酚可显著降低去卵巢大鼠血中骨钙素、IL-1和IL-6水平，减少与雌激素缺乏有关的高骨转换率，增加骨小梁体积和小梁数目［19］。

2.3 抑制甲羟戊酸途径 甲羟戊酸途径是真核细胞中保守的代谢通路，控制胆固醇的生物合成。研究表明，甲羟戊酸途径与骨代谢有关，主要是通过激活鸟苷三磷酸结合蛋白（GTPase）调节成骨细胞和破骨细胞的生成，促进骨质流失［20］。甲羟戊酸抑制剂（如他汀类药物）可增加骨矿物质密度并降低骨折风险，可用于骨质疏松症的治疗［21］。他汀类药物是一种已知的3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A（HMGCoA）还原酶抑制剂，它通过抑制甲羟戊酸途径限速酶HMG-CoA 还原酶活性影响GTPase 激活，GTPase激活受阻导致RANKL 的表达下降和NF-κB 激活受阻，从而抑制破骨细胞分化并诱导破骨细胞凋亡，发挥骨保护作用［20-21］。生育三烯酚尤其是γ-生育三烯酚作为已知的HMG-CoA 还原酶抑制剂，通过下调HMG-CoA 还原酶发挥其骨保护作用，而生育酚则没有类似作用。最近一项体外研究发现［22］，γ-生育三烯酚呈剂量依赖方式刺激小鼠MC3T3-E1 细胞成骨分化，主要表现在MC3T3-E1 前成骨细胞中，γ-生育三烯酚显著增强了碱性磷酸酶（ALP）的活性和骨形态发生蛋白-2（BMP-2）的基因表达，下调了HMGCoA 还原酶的表达，该结果提示生育三烯酚和其他甲羟戊酸抑制剂均具有维持骨骼健康的潜力。在卵巢切除小鼠模型中，口服γ-生育三烯酚（每天60 mg/kg）可有效防止卵巢切除引起的骨丢失，而补充甲羟戊酸可以逆转生育三烯酚的这种骨保护作用，说明生育三烯酚促进骨骼健康可能是通过HMGCoA 还原酶依赖性机制实现的［23］。另一项研究发现，生育三烯酚促进MC3T3-E1 细胞矿化是通过下调HMGR 基因表达从而抑制甲羟戊酸途径和增强MC3T3-E1 细胞中BMP-2 的表达起作用的［24］。此外，生育三烯酚与他汀类药物联合使用还会产生更大的骨骼获益效应。研究发现生育三烯酚（60 mg/kg）与低剂量洛伐他汀（11 mg/kg）联合使用可有效预防卵巢切除引起的骨质疏松症［25］。与洛伐他汀相比，生育三烯酚在骨保护方面有更大的优势，这可能是因为生育三烯酚促进骨重塑是通过多种途径起作用的，而不只是通过甲羟戊酸通路单独起作用的。

2.4 抑制破骨细胞分化 破骨细胞起源于骨髓单核/巨噬细胞系，RANKL 与破骨细胞前体细胞表面核因子-κB 受体活化因子（RANK）结合在诱导破骨细胞前体细胞向成熟破骨细胞分化过程中起关键作用。OPG 可由成骨细胞、骨细胞等分泌，OPG 是已知的RANKL 诱导受体，可阻止RANKL 与RANK 结合，调节破骨细胞增殖分化，抑制骨吸收。破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成的动态平衡使骨骼持续不断地进行骨重塑，以满足人体不同时期的功能需求。然而，长期破骨细胞的骨吸收增加超过成骨细胞的骨形成将会导致骨重塑失衡，引起病理性骨疾病如骨质疏松症。生育三烯酚可通过抑制破骨细胞分化和活性防止骨质流失，促进骨骼健康。研究发现，γ-生育三烯酚呈浓度依赖性抑制破骨细胞形成；浓度为0.1 μmol/L 时，即可抑制RANKL 和M-CSF 诱导的人CD14+细胞来源的破骨细胞形成，具体表现在抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性的多核细胞生成减少，而TRAP 是破骨细胞分化及骨吸收的特异性酶，是破骨细胞分化成熟的标志；浓度为1 μmol/L 时，完全抑制破骨细胞的吸收活性。研究证实，α-生育三烯酚也呈剂量依赖方式抑制小鼠骨髓来源的巨噬细胞分化的TRAP 阳性多核细胞的形成［26］。这与α-生育三烯酚可在破骨细胞形成的早期阶段影响MAPK 活化而直接减少TRAP 阳性破骨细胞的生成，在后期通过抑制细胞外信号调节激酶和NF-κβ的活化来抑制c-Fos表达，进而抑制RANKL 介导的分化过程有关。在尼古丁诱导的骨质疏松大鼠模型中，给大鼠补充γ-生育三烯酚（60 mg/kg）后，大鼠体内的RANKL 表达受到抑制，而OPG mRNA 水平明显增加，骨吸收被抑制［18］。在另一项睾丸切除的骨质疏松大鼠模型中，生育三烯酚（60 mg/kg）可显著降低破骨细胞相关的RANKL基因表达［27］。

2.5 刺激成骨分化相关基因的表达 成骨细胞主要由间充质干细胞分化而来，骨形成过程涉及成骨前细胞增殖，成骨细胞分化和细胞外基质形成。间充质干细胞向各种谱系分化取决于各种转录因子的表达，例如Runt相关转录因子2（Runx2）对于间充质干细胞向成骨细胞分化非常重要，成骨相关转录因子抗体在成骨分化和骨形成中均具有重要作用，此外，还有ALP、I 型胶原（COL1）、β-catenin、BMP-2等［28］。生育三烯酚可促进成骨分化相关基因的表达增加成骨细胞数量、矿物质沉积和骨形成活性，并降低破骨细胞数量、骨侵蚀和骨吸收活性，从而改善骨质减少动物的骨密度和骨微结构退化。研究证实，生育三烯酚显著增强MC3T3-E1 成骨细胞中成骨分化相关基因COL1、ALP、OCN、Osterix 等表达，促进了MC3T3-E1 细胞向成骨细胞分化［22］。在睾丸切除大鼠模型中，生育三烯酚增强了ALP、β-catenin、COL1 等骨形成相关基因的表达并逆转了睾丸激素缺乏大鼠的骨质流失［27］。在卵巢切除大鼠模型中，生育三烯酚上调了BMP-2、OPG、Runx-2、Osterix 及血管内皮生长因子（VEGF）等基因的表达，下调了RANKL的表达，大鼠的骨骼结构和强度均有明显改善［25］。

3 总结与展望

生育三烯酚在抗骨质疏松方面展现出多个靶点作用的潜力，可以通过抗氧化、清除氧自由基、激活Nrf2相关的抗氧化系统以及抗炎活性防止自由基和炎症细胞因子对成骨细胞损伤，提高成骨细胞活性；通过抑制甲羟戊酸途径使破骨细胞分化受阻并促进破骨细胞凋亡；通过抑制RANK-RANKL信号传导通路从而抑制破骨细胞形成；通过增强成骨相关基因的表达促进成骨等多种途径影响骨重塑过程。越来越多的动物实验及临床研究表明，生育三烯酚对骨骼产生的总体效应是有益的。而且，生育三烯酚的生物安全性良好，在防治骨质疏松的同时不会损伤正常细胞，这使得生育三烯酚的临床应用前景更加受人关注。但是，生育三烯酚防治骨质疏松症的作用还需要进一步的临床研究验证。