骨髓间充质干细胞来源外泌体Zeb2在大鼠缺血性脑损伤后的表达及其意义

尚欣颖，张玮

昆明医科大学第一附属医院，昆明650032

卒中是导致我国居民死亡的主要原因之一［1］，其中急性缺血性脑卒中（AIS）占卒中患者的绝大多数［2］。重组组织型纤溶酶原激活剂或尿激酶静脉溶栓治疗和血管内机械取栓是目前临床推荐的AIS 治疗方法，但严格的入选标准和禁忌证限制了该方法在临床实践中的应用范围［3-4］，导致很多患者遗留下严重的神经功能缺陷。因此，探求新的安全有效的治疗方法十分必要。近年来，骨髓间充质间充质干细胞（BMSC）作为一种治疗神经系统疾病的新方法得到关注，其通过释放外泌体将各种生物活性分子从供体细胞转移到受体细胞从而发挥作用［5-6］。锌指E盒结合同源盒2（Zeb2），又称SMAD 相互作用蛋白-1（SIP1）或ZFHX1B，是一种DNA 结合转录调控因子，参与大肠癌、乳腺癌、Mowat-Wilson 综合征等疾病的发生以及神经细胞增殖、分化、存活、凋亡等重要生物学过程［7-8］，但其对缺血性脑卒中后的神经保护作用还未见报道。本文通过构建大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，检测其BMSC 及其外泌体Zeb2基因相关表达情况，并探讨缺血性脑损伤与Zeb2 的关系，从而为缺血性脑卒中的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：SPF 级SD 雄性成年大鼠18只，体质量250～350 g，由昆明医科大学实验动物学部提供，均分笼饲养在通风良好、水和食物充足的恒温环境中。试剂及仪器：佳灵线栓购于广州佳灵生物科技有限公司，胎牛血清购自美国Gibco 公司，Zeb2 抗体购自英国Abcam 公司，β-actin 抗体购自上海AbMART 公司，HRP 标记通用型二抗（goat 来源）购自德国CST公司。外泌体提取试剂盒购自广州锐博公司，无外泌体血清购自上海VivaCell 公司，PVDF 膜购自购自Millipore 公司，应用Beacon Designer7.90 设计引物，实时荧光定量PCR 仪购自西安天隆公司，超低温冰箱（-80 ℃）购自美国Thermo公司等。

1.2 大鼠大脑中动脉缺血再灌注（MCAO）模型制备及分组 将18只6～8周龄的SD雄性大鼠随机分为假手术组和MCAO 模型组各9 只，MCAO 模型为模拟人类缺血性脑卒中的常用模型。将模型组SD成年大鼠以1 mL/300 g 剂量腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，麻醉后固定小鼠，碘伏消毒后取颈部正中切口约1.5 cm。暴露右侧颈三角后分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），用3-0 缝合线将右侧CCA 扎闭，在距CCA 分叉1 cm处打一松结备用，再用3-0 缝合线将ECA 扎闭（尽量靠近CCA 分叉处），用微血管夹夹闭ICA。在CCA备用线近心端2 mm处用显微剪开一个小口，插入佳灵线栓，系紧松结。移去ICA 的微血管夹，调整方向，将线栓插入ICA，当感到有阻力时，停止进线栓。将剪口处松结打死，剪去多余的线栓，缝合2～3 针，防止大鼠醒时线栓脱出。缺血2 h后，异氟烷气体麻醉拔出线栓，待大鼠苏醒后放回笼内饲养。假手术组仅结扎ICA，不阻塞大脑中动脉，造成与模型组同样的手术损伤。

1.3 神经功能学评分 再灌注24 h 后，采用Bederson 方法对神经功能缺陷进行评分［9］。具体标准为：0分表示神经功能没有缺失、1分表示向左侧前肢内向屈曲、2 分表示向左侧行走、3 分表示以追尾状的形式向左侧转圈。高于1分的大鼠参与后续实验。

1.4 BMSC 细胞培养及外泌体提取 神经功能学评分结束后，立即麻醉后快速脱颈法处死大鼠。无菌条件下将股骨完整的剪下放入盛有DMEM/F12基础培养基的培养皿内，用2.5 mL 注射器吸取DMEM/F12 培养基后将骨髓从骨髓腔内冲出，冲至股骨变白为止。随后用移液器吹打至单细胞悬液，1 000 r/min 离心3 min 收集细胞。用5 mL DMEM/F12 完全培养基重悬细胞后接种至T25 瓶内，37 ℃5% CO2培养箱内进行培养。接种24 h 后部分细胞贴壁，贴壁细胞呈圆球状，未长出形态，培养液中有大量未贴壁细胞，换液后继续培养。3 d时细胞开始长出形态但未完全长开，细胞呈梭型生长；5 d 时所有细胞都已经长出形态，细胞形态伸展，呈梭型生长，融合度50%左右；7 d 时细胞融合度达到70%左右；10 d 时细胞融合到90%以上，细胞状态良好，胞体透亮，折光性良好，细胞呈放射状或漩涡状生长，0.25%胰酶消化传代。传至第2、3 代时绝大部分的造血干细胞已经除尽，可以进行实验。细胞传代时，用于后续提取外泌体的细胞，待细胞过夜培养后，更换为不含外泌体血清的完全培养基培养24 h。收集细胞上清和血清分开于2 支15 mL 离心管离心，室温2 000 g 离心30 min 分别去除细胞上清和血清中的细胞碎片及杂质。离心后更换至相应的10 mL 离心管，每管加入1/3 体积的锐博外泌体提取试剂，混匀后4 ℃冰箱放置过夜，1 500 g 4 ℃离心30 min，弃上清，管底灰白色沉淀即为外泌体。

1.5 Zeb2 mRNA 检 测 采 用RT-PCR 法。 在Pubmed 上查询SD 大鼠的目的基因Zeb2 mRNA 序列，以CDS 序列设计引物。应用beacon designer7.90 设计Q-PCR 引物，采用RNA 提取试剂盒提取两组经处理过BMSC、BMSC 外泌体及血清外泌体的总RNA，取3 μL 总RNA 样品在ND-1000 分光光度计中测其浓度。按照合成20 μL cDNA 需要总RNA样品为2 μg计算所需总RNA的体积计算，逆转录中所需总RNA 的体积量=1μg/测得的RNA 浓度。先按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒说明合成cDNA 第1 条链，再根据SYBR Green qPCR试剂盒说明书，以β-actin为内参，以cDNA第1链为模板进行PCR 反应，95 ℃预变性10 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s为反应条件进行40个循环，采用公式2-ΔΔCt计算各组β-actin和Zeb2基因表达量。

1.6 Zeb2蛋白表达检测 采用Western blotting 法。收集经处理过的细胞，PBS 洗涤细胞后加入RIPA 裂解液离心后制备BMSC 蛋白样品，然后根据BCA 试剂盒说明书操作进行蛋白浓度测定。SDS-PAGE 电泳后采用湿转法转膜到PVDF 膜上，将PVDF 膜置于5%牛血清白蛋白室温20～30 ℃封闭1 h 后，用1∶1 000稀释过的一抗Zeb2抗体、β-actin抗体在4 ℃冰箱中过夜；取出杂交袋，室温复温10 min，去除一抗液体，缓冲液洗膜3次，加入稀释好的二抗（1∶2 000）避光室温孵育2 h；采用ECL 显色，凝胶成像仪曝光观察并拍照，最后采用Image J 对蛋白条带灰度进行定量分析。BMSC 外泌体和血清外泌体提取完成后进行外泌体蛋白浓度测定，其余步骤如上。

1.7 统计学方法 采用SPSS25.0 进行数据统计分析，计量资料符合正态分布以±s表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组神经功能学评分结果的影响 缺血再灌注24 h后分别测假手术组和模型组的神经功能缺陷评分，假手术组神经功能缺陷评分为0分，模型组神经功能缺陷评分为（2.67±0.51）分，两组差异具有统计学意义（P＜0.05）；表明成功构建了大鼠MCAO模型。

2.2 两组Zeb2 mRNA 表达 假手术组BMSC、BMSC 外泌体及血清外泌体Zeb2 mRNA 的相对表达量分别是1.35±0.30、1.09±0.11、1.11±0.48；模型组BMSC、BMSC外泌体及血清外泌体Zeb2 mRNA的相对表达量分别为15.00±2.43、10.34±3.36、7.48±2.35。与假手术组比较，模型组BMSC、BMSC 外泌体及血清外泌体Zeb2 mRNA 相对表达量呈上升趋势，两组差异具有统计学意义（P均＜0.05）。

2.3 两组Zeb2 蛋白的表达 缺血再灌注处理后，模型组BMSC、BMSC外泌体及血清外泌体中Zeb2蛋白的相对表达量依次为1.03 ± 0.13、1.08 ± 0.15、1.12±0.17；假手术组的Zeb2 蛋白相对表达量分别为0.71 ± 0.10、0.74 ± 0.14、0.76 ± 0.10。两组相比，模型组BMSC、BMSC 外泌体及血清外泌体Zeb2蛋白表达水平呈明显上升趋势，两组差异具有统计学意义（P均＜0.05）。

3 讨论

缺血性脑卒中主要是由大脑动脉闭塞，患者脑组织出现局部或大面积缺氧缺血，发生神经元细胞凋亡和脑组织坏死，是世界范围内神经系统常见的高发病率、高病死率和高致残率的疾病之一［10-11］。因此，寻找新的治疗策略，保护受损的神经细胞和神经功能，防止缺血性脑卒中急性期脑组织再灌注期损伤有重要意义。

由于脑部特殊的解剖结构及中枢神经系统的复杂性，在治疗缺血性脑卒中时往往要考虑药物是否能有效到达脑组织。BMSC 是一种成熟的多能干细胞，可分化为多种类型的细胞，包括脂肪细胞、软骨细胞、神经和肝细胞等［12］。既往研究发现，BMSC 可通过促进血管生成、神经再生和髓鞘形成等途径改善脑卒中后的神经功能预后，BMSC 移植治疗脑卒中有肯定疗效。但是，由于BMSC 移植后出现并发症如细胞免疫排斥反应、使用前的储存问题及致瘤性等问题的困扰，BMSC 疗法受到较大限制［13］。近年来研究表明，BMSC 细胞移植治疗脑卒中最有可能通过旁分泌机制发挥作用，而在BMSC 的衍生分泌物中，外泌体已经引起了大家广泛的研究兴趣。外泌体是一种直径30～100 nm 的微小膜泡，内含多种mRNA、DNA、蛋白质等生物活性物质，具有跨越血脑屏障及血脑脊液屏障的能力。同时，有研究表明BMSC 来源的外泌体对急性缺血性脑卒中康复的治疗效果与BMSC 的治疗效果相当，这说明是BMSC来源的外泌体，而不是BMSC，参与缺血性脑卒中后相关基因调控及其功能表达的过程［14-15］。

Zeb2 在分离编码能与异源表达的非洲爪蟾Smad1（XSmad1）的MH2 结构域结合蛋白过程中首次发现［16］。研究表明，在脊髓损伤或急性缺血性脑卒中小鼠模型星形胶质细胞中，Zeb2 的靶向敲除可减轻星形胶质细胞增生，增加病变面积，并损害运动功能的恢复［17］。有研究者指出，Zeb2 是神经元发育中起重要的转录因子，Zeb2突变会导致莫瓦特-威尔逊综合征，此时个体表现出多种严重的神经发育缺陷，如小头畸形、癫痫、运动发育迟缓等［18］。因此，为了从细胞水平研究Zeb2 对缺血性脑损伤的神经保护作用，我们构建了活体大鼠MCAO模型，缺血再灌注24 h 后取大鼠股骨骨髓进行BMSC 原代培养及其外泌体提取，同时取血液离心获取血清，提取血清中的外泌体，再采用RT-PCR、Western blotting 方法检测假手术组和模型组BMSC、BMSC 外泌体、血清外泌体中Zeb2 mRNA、蛋白表达情况，显示模型组BMSC、BMSC 外泌体及血清外泌体Zeb2 mRNA、蛋白表达水平明显上升，说明在脑损伤后机体可能会通过刺激Zeb2 的表达从而达到神经保护的作用。同时提示我们，通过调控BMSC 来源外泌体中Zeb2 表达水平进行急性缺血性脑卒中的治疗可以作为未来研究方向。此外，Zeb2在肿瘤发生的上皮细胞-间充质转化过程中也起着关键的调节作用，可激活细胞增殖、迁移和侵袭能力［19］，如MicroRNA-545 通过靶向负调控Wnt/β-catenin 通路中Zeb2 的表达抑制非小细胞肺癌的发展［13］。有研究表明，Zeb2 通过激活smad7 抑制β-catenin 对少突胶质细胞前体细胞的负调节，从而促进少突胶质细胞的分化，参与中枢神经系统的髓鞘形成以及髓鞘损伤修复［20］。因此，我们推测BMSC 来源外泌体Zeb2 可能通过参与Wnt/βcatenin通路影响缺血性脑卒中后的恢复过程。

综上所述，BMSC 及外泌体Zeb2 基因在大鼠缺血再灌注损伤后的表达明显上调，说明Zeb2 可能具有神经保护的作用，提示BMSC 来源的外泌体Zeb2可能成为人类缺血性脑卒中疾病潜在的诊断和治疗靶点。