MMP-9在慢性缺氧大鼠血浆中表达及唐古特青兰的保护作用①

李 欣,初而复，卢均坤(.佳木斯大学附属第一医院心内科, 黑龙江 佳木斯 54003;2.黑龙江省医院心内科，黑龙江 哈尔滨 50000)

慢性缺氧能引起人体发生多种不良反应，包括循环系统、神经系统、消化系统、泌尿系统、免疫系统等多种系统脏器损伤，其中以循环系统中心脏损伤对机体造成的损伤最严重，慢性缺氧能导致心肌组织发生纤维化，进而引起心肌重塑，从而影响心功能。慢性缺氧可导致肺心病、冠心病等多种循环系统疾病的发生与发展。近几年有研究发现[1]，慢性缺氧所致心肌组织纤维化发生的机制主要与慢性缺氧导致心肌细胞外间质胶原过度沉积及心肌细胞各型胶原比例失调密切相关。MMP-9是一种肽链内切酶，具有调节心肌细胞各型胶原比例及降解心肌细胞外胶原基质成分的作用。但目前对于慢性缺氧所致血浆中MMP-9表达量变化的影响及其机制的研究，国内外相关研究较少。

目前，藏药唐古特青兰的生理学作用日益受到国内外学者重视。目前各方面研究主要集中在对唐古特青兰治疗消化系统及免疫系统疾病等方面所起作用机制的研究[2]，但关于唐古特青兰保护心肌组织机制的研究较少，唐古特青兰保护心肌组织的机制与途径目前尚不明确。本实验通过构建慢性缺氧所致心肌损伤的模型，应用唐古特青兰对已发生心肌损伤的模型进行干预，从而进一步研究MMP-9、BNP在唐古特青兰干预慢性缺氧所致心肌损伤中的表达情况并深入探讨唐古特青兰对慢性缺氧所致心肌损伤的保护作用的具体机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年健康雄性SD大鼠，体质量170～210g，共60只。

1.2 实验仪器及试剂

血浆BNP、MMP-9 ELISA试剂盒由美国R&D公司进口，上海活乐生物有限责任公司提供。

1.3 动物模型的建立

将60只成年健康雄性SD大鼠随机分为3组，每组20只，分别标记为对照组(A组)、慢性缺氧损伤+唐古特青兰干预组(B组)、慢性缺氧损伤组(C组)，B组大鼠经腹腔注射2g/kg的唐古特青兰(纯化浸膏), A组和C组则注射等量的生理盐水注射液。给药24h后,将B组和C组大鼠放入乏氧动物饲养箱内饲养,通入氮氧混合气体(N2∶O2=90∶10),测氧仪监测乏氧箱内氧浓度, 乏氧箱内放置氯化钙和钠石灰吸收箱内CO2和H2O，8h后将大鼠取出, 置于常氧动物饲养箱内继续饲养,第2天重复以上过程,共持续2W。

1.4 检测BNP、MMP-9

应用酶联免疫吸附(ELISA)法, 腹主动脉采血，静置0.5h后3000r/min离心20min，取离心管上层血浆置于EP管中，放入-80℃电冰箱内储存。用血浆BNP、MMP-9 ELISA试剂盒检测大鼠血浆中BNP、MMP-9浓度，操作过程及步骤严格按照试剂盒说明书要求进行。

1.5 统计学方法

2 结果

B组大鼠血浆中BNP及MMP-9表达量均显著低于C组(P<0.05)，而明显高于A组(P<0.05)，MMP-9与BNP呈正相关 (rA=0.823, rB=0.805，rC=0.727)，见表1。

表1 给药2周后各组大鼠BNP及MMP-9比较

3 讨论

心肌组织是机体内对慢性缺氧十分敏感的器官。慢性缺氧可通过多种途径导致心肌组织代谢异常、引起心功能下降，慢性缺氧所致的心肌组织损伤是多种循环系统疾病发生和发展过程中重要的病理生理改变途径之一，在成年人多见于肺心病、冠心病等慢性缺氧性疾病;在儿童则多见于多种类型的紫绀型先天性心脏病等。慢性缺氧可通过多种机制与途径作用于心肌组织，对心功能造成一系列影响。慢性缺氧可直接作用于心血管内皮平滑肌细胞,使心脏大血管呈收缩状态、使血管内血流阻力增加;同时，慢性缺氧也能使机体内醛固酮、血管紧张素和内皮素等含量升高，上述多种介质作用于肺组织,导致肺血管内皮增厚、平滑肌增生,导致肺动脉压力增高，从而导致肺心病出现，严重影响心功能[3]。近年来有研究表明，慢性缺氧主要影响右心室的结构与功能，导致右心室心肌组织发生纤维化，心肌组织纤维化是以心肌细胞外间质胶原过度沉积、各型胶原比例失调为主要特征，是多种循环系统疾病发生与发展的主要作用机制[4]。并且心肌组织发生纤维化的过程是心肌结构重塑过程中心功能由代偿期进展为失代偿期过程中的重要环节之一。有学者认为，慢性缺氧能导致肺动脉压持续升高，右心室压力负荷升高，进而引起右心室心肌细胞肥大、结构重塑、心腔扩大。也有研究表明，当全心同时处于慢性缺氧状态时，仅右心室心肌组织受影响而发生纤维化，而其它心腔的心肌组织并不发生纤维化，这说明并非慢性缺氧直接作用于心肌组织产生的结果;并且慢性缺氧仅引起肺动脉压力呈增高状态，而心脏其它大动脉及全身大动脉压力并无明显增高。也有研究表明，处于慢性缺氧状态下饲养的大鼠右心室收缩压与右心室心肌组织胶原含量及右心室心肌组织内Ⅰ/Ⅲ型胶原比例呈显著正相关性[5]。目前认为，慢性缺氧所致心肌组织内胶原代谢障碍是引起右心室心肌组织发生纤维化的主要原因。

MMPs是一类Zn2+依赖性肽链内切酶家族，首先以无活性的酶原形式分泌，经多种激活途径激活后成为有活性的内切酶，发挥水解蛋白质及降解细胞外基质胶原的作用。MMPs家族中重要成员：MMP-9，其前体能由血管内皮细胞、炎症细胞、血管平滑肌细胞、癌细胞及成纤维细胞等多种细胞所分泌，被相关蛋白酶系水解激活后，成为有活性的MMP-9，参与机体炎症反应、组织重塑、创伤修复及炎症因子的表达等多种生理过程[6]。人MMP-9的表达是在转录水平上发生原始调控，其启动子的反应元件是多种因素诱导MMP-9表达的最终靶点。MMP-9的蛋白组学构成包括催化域(包含Zn2+结合位点)、功能域(类纤维黏连蛋白样功能)和Ⅴ型胶原样功能域。其中MMP-9具有独特的Ⅴ型胶原样功能域，而MMPs家族中其他成员则不具有该功能域，其中MMP-9前肽序列在其酶原被激活过程中发挥关键作用[7]。MMPs家族中多种内切酶均具有降解心肌组织内Ⅳ型胶原的作用，但以MMP-9的降解作用最为重要、调控途径也最为精细。在正常成人体内，MMP-9呈低表达状态，但在一些特定的病理生理过程中可呈高表达状态[8]。但目前关于MMP-9的表达与慢性缺氧所致心肌损伤之间相关性的研究报道较少。

BNP是神经内分泌系统中的一个重要因素，在心室肌牵张及心室后负荷增加时其由心室释放入血，BNP不仅具有排钠、利尿、扩张血管等作用，还能抑制RASS激活、抑制交感神经兴奋[9]。关于心肌慢性缺氧导致BNP合成与分泌调节机制的研究较少，耿旭等[10]研究表明，BNP的合成与分泌与心室容积及心室壁所受张力大小无关，慢性缺氧可直接作用于机体心肌组织，导致心肌组织BNP合成并分泌入血。Wen[11]等研究发现，在慢性缺血缺氧条件下，白细胞介素6首先被激活，进而启动转化生长因子β1/Smad2信号,从而参与BNP的合成。目前认为，在BNP的基因转录过程中，多种炎性细胞因子参与其中，HIF-1α及其类似物扮演重要角色，并可能在未来心肌急慢性缺血缺氧的基因治疗中发挥重要作用[12]，而BNP与慢性缺氧时的心肌纤维化关系的相关研究目前较少。

藏药唐古特青兰又名甘青青兰，主要含有黄酮甙、胡萝卜甙、脂类、氨基酸等。研究发现，唐古特青兰纯化物具有降低动物机体氧耗、保证缺氧状态下能量代谢等作用，对组织长期慢性缺氧具有明显的干预与保护作用[13,14]。但唐古特青兰对慢性缺氧所致大鼠心肌损伤模型的保护作用及其机制方面的研究目前报道较少，本实验通过建立慢性缺氧SD大鼠模型，应用ELISA法，研究藏药唐古特青兰对慢性缺氧大鼠血清BNP、MMP-9表达量的影响，为我国藏药治疗慢性缺氧所致的多种心脏疾病提供基础理论依据。

本实验通过BNP、MMP-9 ELISA试剂盒检测大鼠血浆BNP、MMP-9表达量，结果显示，B组大鼠血浆BNP表达量明显低于C组(P<0.05)，而明显高于A组(P<0.05)。本实验结果表明在体内模型中，正常心肌组织分泌少量BNP及MMP-9，慢性缺氧时BNP及MMP-9分泌增加，但当加入一定浓度的唐古特青兰后，会减少慢性缺氧的心肌组织BNP及MMP-9分泌量，这表明唐古特青兰对慢性缺氧所引起的心肌细胞损伤具有一定的保护作用，同时也说明虽然唐古特青兰具有明确的保护作用，但其并不能将受损的心肌细胞完全恢复至正常，这可能受到唐古特青兰浓度及慢性缺氧作用时间的影响。

本实验通过构建慢性缺氧所致大鼠心肌损伤的体内模型，使用唐古特青兰对已发生心肌损伤的动物模型进行干预，研究结果表明藏药唐古特青兰对慢性缺氧所致SD大鼠损伤的心肌细胞具有一定的保护作用，而这种保护作用是否是通过调节动物模型体内的BNP、MMP-9表达情况来发挥作用还有待进一步研究。本实验揭示了慢性缺氧在机体内对心肌细胞造成损伤的机制及唐古特青兰在体内对抗慢性缺氧所引起心肌细胞损伤的主要途径，为进一步研究MMP-9在唐古特青兰干预慢性缺氧所致心肌损伤中的表达情况，及深入探讨唐古特青兰对慢性缺氧所致心肌损伤的保护作用及其具体机制提供了新的科研思路，为今后慢性缺氧所致心脏疾病的靶基因治疗提供理论依据。