富白细胞-富血小板纤维蛋白的凝胶联合BMSCs修复股骨头缺血性坏死实验研究①

季庆辉, 薛 宇, 姬宇辉, 刘士臣, 乔建民,乔晓峰(佳木斯大学临床医学院，黑龙江 佳木斯 154003)

股骨头缺血性坏死(avascular necrosis of the femoral head， ANFH)由于股骨头受损或血供中断，产生骨细胞及骨髓成分死亡[1]，导致其结构改变、塌陷、功能障碍疾病，股骨头缺血性坏死导致患者致残率非常高，是骨外科常见极难治愈疾病[2]。富白细胞-富血小板纤维蛋白 (Leukocyte-and platelet-rich fibrin，L-PRF)凝胶是采集富含白细胞-富含血小板血浆血液放入离心管中离心浓缩制备而成。 L-PRF凝胶是一种含有丰富的自体血小板与白细胞纤维蛋白物[3]，富含血小板的血浆中含有大量(血小板衍生、转化、类胰岛素、表皮、血管内皮)等生长因子及(血纤维蛋白)蛋白质，L-PRF凝胶对成骨细胞有修复愈合促进作用[4]。骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)是具有慢周期性、自我更新能力的原始祖或未分化细胞[5]，BMSCs具有支持造血细胞、调节免疫的功能可以与其他干细胞构成结缔组织支架，分泌细胞外基质蛋白，调节造血细胞增殖和归巢[6]。L-PRF凝胶结合BMSCs修复股骨头缺血性坏死实验研究，主要探索L-PRF凝胶结合BMSCs修复股骨头缺血性坏死，为临床治疗L-PRF凝胶结合BMSCs修复股骨头缺血性坏死提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康正常新西兰大白兔30只, 雌雄各1/2，4 月龄，体重(2400±300) g, 大白兔由佳木斯大学实验动物中心提供。

1.2 试剂与实验仪器

1.2.1 主要试剂。DMEM/F12(1:1)液体培养基(HyClone,美国犹他州洛根市)，CellMax标准胎牛血清(赛澳美细胞技术(北京)有限公司)，胰蛋白酶(武汉普诺赛生命科技有限公司)，牛凝血酶(上海经科化学科技有限公司)，预染蛋白Marker(北京聚合美生物科技有限公司)，25%戊二醛(上海海曲化工有限公司)，无水乙醇(沈阳萨雷硕化学试剂有限公司)，乙酸异戊酯(苏州友欣香料化工有限公司)，40%甲酸溶液(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.2.2 实验仪器。SW-CJ系列医用型超净工作台(上海诺萱科学仪器有限公司)，常温高速离心机(长沙湘锐离心机有限公司)，低温高速离心机(长沙湘锐离心机有限公司)，-40～-86℃卧式超低温冰箱(广州傲雪制冷设备有限公司)，常规手术器械(佳木斯大学临床医学院实验室)，徕卡显微镜DM750专业生物显微镜(德国，Leica)[7]。

1.3 L-PRF凝胶制备

健康正常新西兰大白兔股静脉处采血10mL、放置于无抗凝剂无菌离心管中、3000rpm/min(1408×g)10min、室温静置10min、得到3层血液样本、弃去顶层(淡黄色淡澄清液体)和底层(红细胞碎片)、取出中间层(淡黄色凝胶)、初级L-PRF凝胶 、静置干燥无菌容器10min 、无菌纱布吸附释放血清、L-PRF凝胶[8]。

1.4 BMSCs分离培养

健康正常新西兰大白兔双侧髂后上嵴穿刺抽取骨髓5mL、加入L一DMEM培养液、制成混合细胞悬液、收集细胞加入磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释2倍均匀混合、2000rpm/min 20min、取云雾状中层细胞、100mL/L胎牛血清培养液加入10cm细胞培养皿、2×105云雾状细胞接种、清除不贴壁造血细胞、纯化BMSCS细胞液、调节1×106/mL细胞密度[9]。

1.5 股骨头缺血性坏死(ANFH)动物模型制备

健康正常新西兰大白兔长耳边缘、每次间隔24h静脉2次注射10μg/kg脂多糖(LPS)、第2次静脉注射10μg/kg脂多糖(LPS)、新西兰大白兔臀大肌、每次间隔24h肌注3次10mg/kg地塞米松磷酸钠、预防感染7d肌注青霉素4.790mg、42d动物模型制备完成[10]。

1.6 L-PRF凝胶联合BMSCs修复股骨头缺血性坏死实验动物分组

健康正常新西兰大白兔30只随机分为 5 组，每组6只。A：对照组;B：模型组;C：L-PRF组;D：BMSCs组;E：L-PRF+ BMSCs联合组[11]。

1.7 股骨头缺血性坏死(ANFH)动物模型修复方法

L-PRF凝胶联合BMSCs修复股骨头缺血性坏死实验修复方法，A：对照组。不造模，不处理。B：模型组，模型制成立即将切口缝合。C：L-PRF组，模型制成将50 μg L-PRF凝胶植入缺损区，随既用骨蜡密闭骨孔，然后立即将切口缝合。D：BMSCs组，模型制成将吸取50 μL 1×106/mL BMSCS细胞液植入缺损区，随既用骨蜡密闭骨孔，然后立即将切口缝合。E：L-PRF+ BMSCs联合组。模型制成将50 μg L-PRF凝胶+50 μL 1×106/mL BMSCS细胞液植入缺损区，随既用骨蜡密闭骨孔，然后立即将切口缝合[12]。

1.8 统计学方法

采用SPSS20.0进行平均数和标准差分析处理。

2 结果

2.1 L-PRF凝胶联合BMSCs修复股骨头缺血性坏死实验各组病理组织学观察

通过病理组织学观察L-PRF凝胶联合BMSCs修复股骨头缺血性坏死实验各组股骨头坏死发展及修复情况[13],见表1。

表1 L-PRF凝胶联合BMSCs修复股骨头缺血性坏死实验修复组织情况

2.2 L-PRF凝胶联合BMSCs修复股骨头缺血性坏死实验各组分别三个时间点新生骨面积百分比比较

L-PRF凝胶联合BMSCs修复股骨头缺血性坏死实验各组分别在 14d、28d、56d 进行新生骨面积百分比比较，也就是用新生骨面积与缺损区面积进行对比得出百分比，然后进行不同处理修复效果比较。A对照组：不造模，不处理不影响新生骨面积；B模型组：造模，切口缝合处理新生骨面积百分比显著下降(P<0.05)；C L-PRF组：50 μg L-PRF凝胶植入缺损区，切口缝合处理、D BMSCs组：50 μL 1×106/mL BMSCS细胞液植入缺损区，切口缝合处理、E L-PRF+ BMSCs联合组：50 μg L-PRF凝胶+50 μL 1×106/mL BMSCS细胞液植入缺损区，切口缝合处理三组新生骨面积百分比均明显上升，其中EL-PRF+ BMSCs联合组上升显著。L-PRF凝胶联合BMSCs修复股骨头缺血性坏死实验不同时间新生骨面积百分比比较,见表2。

表2 L-PRF凝胶联合BMSCs修复股骨头缺血性坏死实验不同时间新生骨面积百分比比较

2.3 L-PRF凝胶联合BMSCs修复股骨头缺血性坏死实验骨陷窝空缺率比较

骨组织由骨细胞与纤维和细胞基质三部分组成，骨细胞在骨细胞基质占椭圆形小腔称为骨陷窝，通过L-PRF凝胶联合BMSCs修复股骨头缺血性坏死实验观察骨陷窝空缺率可以比较修复效果。

A对照组：不造模，不处理不影响骨陷窝；B模型组：造模，切口缝合处理显著增加骨陷窝空缺率(P<0.05)；C L-PRF组：50 μg L-PRF凝胶植入缺损区，切口缝合处理、D BMSCs组：50 μL 1×106/mL BMSCS细胞液植入缺损区，切口缝合处理、E L-PRF+ BMSCs联合组：50 μg L-PRF凝胶+50 μL 1×106/mL BMSCS细胞液植入缺损区，切口缝合处理三组骨陷窝空缺率均明显下降，其中E L-PRF+ BMSCs联合组下降显著。L-PRF凝胶联合BMSCs修复股骨头缺血性坏死实验骨陷窝空缺率,见表3。

表3 L-PRF凝胶联合BMSCs修复股骨头缺血性坏死实验骨陷窝空缺率(%)

3 讨论

股骨头缺血性坏死(avascular necrosis of the femoral head， ANFH)分为创伤和非创伤两大类。创伤和非创伤两大类股骨头缺血性坏死引起主要原因：(1)创伤性主要由①股骨颈骨折、②髋关节脱位、③髋部外伤三种创伤引起；(2)非创伤性主要由①应用皮质类固醇、②酗酒二种原因引起。临床表现：(1)早期症状不典型，主要表现是髋关节疼痛；(2)晚期症状主要表现①股骨头塌陷、②髋关节脱位、③Allis征、④单腿独立试验征阳性四方面。临床检查方法：临床检查主要方法①临床检查、②X线摄片、③MRI扫描、④核素扫描、⑤CT检查五种方法。诊断：主要包括①主要标准、②次要标准、③其他三方面。手术治疗：主要包括①股骨头髓芯减压术、②带血管自体骨移植、③不带血管骨移植、④截骨术、⑤人工关节置换术5种方法。

富白细胞-富血小板纤维蛋白 (Leukocyte-and platelet-rich fibrin，L-PRF)凝胶是固态可以形成立体网状结构降解缓慢发挥作用时间长，在创伤部位可以促进修复愈合。L-PRF是一种含有丰富的自体血小板与白细胞纤维蛋白物，富含血小板的血浆中含有大量(血小板衍生、转化、类胰岛素、表皮、血管内皮)等生长因子及(血纤维蛋白)蛋白质，L-PRF凝胶对成骨细胞有修复愈合促进作用，L-PRF凝胶具有接近生理状态特点促进组织再生生物学性能[14]。

骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)来源广泛易于分离培养，具有较强分化潜能和可自体移植特点。BMSCs与其它间充质干细胞构成结缔组织支架，具有防止免疫移植失败和免疫调节作用。BMSCS可以多向分化为成骨细胞等也就是具有可塑性，BMSCS自体移植能够重新形成修复关节面[15]。

实验研究L-PRF凝胶联合BMSCs修复股骨头缺血性坏死不同时间新生骨面积百分比比较，A对照组：不造模，不处理不影响新生骨面积；B模型组：造模，切口缝合处理新生骨面积百分比显著下降(P<0.05)；C L-PRF组：50 μg L-PRF凝胶植入缺损区，切口缝合处理、D BMSCs组：50 μL 1×106/mL BMSCS细胞液植入缺损区，切口缝合处理、E L-PRF+ BMSCs联合组：50 μg L-PRF凝胶+50 μL 1×106/mL BMSCS细胞液植入缺损区，切口缝合处理三组新生骨面积百分比均明显上升，其中EL-PRF+ BMSCs联合组上升显著。

实验研究L-PRF凝胶联合BMSCs修复股骨头缺血性坏死骨陷窝空缺率比较，A对照组：不造模，不处理不影响骨陷窝；B模型组：造模，切口缝合处理显著增加骨陷窝空缺率(P<0.05)；C L-PRF组：50 μg L-PRF凝胶植入缺损区，切口缝合处理、D BMSCs组：50 μL 1×106/mL BMSCS细胞液植入缺损区，切口缝合处理、E L-PRF+ BMSCs联合组：50 μg L-PRF凝胶+50 μL 1×106/mL BMSCS细胞液植入缺损区，切口缝合处理三组骨陷窝空缺率均明显下降，其中E L-PRF+ BMSCs联合组下降显著。

实验结果证实L-PRF凝胶联合BMSCs修复股骨头缺血性坏死三种修复处理L-PRF凝胶与BMSCs和L-PRF+ BMSCs联合均有效果，其中以L-PRF+ BMSCs联合修复股骨头缺血性坏死效果最佳。