蒙药地梢瓜修复LPS诱导的NCM460细胞损伤的有效部位筛选

喜杰，宝开花

（内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古 通辽）

0 引言

蒙药地梢瓜是蒙医临床从古至今一直使用的止泻药，是内蒙古地区生长的道地蒙药材之一。地梢瓜在蒙医临床常用作“清协日”，药性凉，具有清协日，止泻功效，常用于协日性腹泻，腑热，肠刺热等症[1]。有关地梢瓜化学成分研究，王玎等[2]对地梢瓜果实进行分离纯化，得到6个三萜类化合物，分别鉴定为b-香树脂醇乙酸酯、羽扇豆醇乙酸酯、a-香树脂醇正辛烷酸酯、a-香树脂醇、b-香树脂醇、齐墩果酸等。李熠等[3]对地梢瓜叶中总黄酮进行了提取及含量测定，结果显示总黄酮含量为2.116mg/g。然而，关于地梢瓜药理作用及其药效等研究尚未见有报道。

研究发现[4]，炎症模型小鼠受到白介素-8（interleukin-8，IL-8）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）刺激，会造成其肠粘膜上皮细胞凋亡、脱落，同时伴随粘膜屏障的损坏导致向腔外释放细菌及毒力因子和各种趋化因子，从而激活免疫细胞导致炎症发生。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）也称作内毒素[5]，是革兰氏阴性细菌细胞壁外的一种强促炎分子，由保守的脂质A与多聚糖组成。LPS能够引起多种细胞的凋亡。肠粘膜屏障是维持肠体内平衡的重要结构，已经证实由IL-8和TNF-α引起的肠细胞过度凋亡以及紧密连接蛋白功能异常能够导致严重的肠功能素乱[6]。本研选用人正常结肠上皮细胞NCM460，通过LPS诱导细胞凋亡，地梢瓜不同提取物作用于诱导的细胞模型上，观察地梢瓜不同提取部位对细胞凋亡的影响，以及对炎性因子IL-8和TNF-α的调控作用，期为该药物对结肠粘膜屏障损伤机理研究提供实验依据，为该药的进一步研究提供新思路，新方法。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

NCM460细胞（商城北纳创联生物科技有限公司）；1640细胞培养液（商城北纳创联生物科技有限公司）；PB磷酸盐缓液（Phosphate Buffered Saline，PBS）（海标科技生物有限公司）；胰蛋白酶（北京百奥莱博科技有限公司）；MTT试剂盒、IL-8试剂盒、TNF-α试剂盒（上海原叶生物技术有限公司）；二甲基亚砜（南京化学试剂有限公司）；地梢瓜（自采于内蒙古通辽市科左中旗）；乙醇[阿拉丁试剂（上海）有限公司]，正丁醇[阿拉丁试剂（上海）有限公司]，石油醚[阿拉丁试剂（上海）有限公司]，乙酸乙酯[阿拉丁试剂（上海）有限公司]。

1.2 仪器设备

5%CO2恒温培养箱（三洋）；无菌操作台（苏州智净净化）；HH－S266数显恒温水浴锅（上海赫田科学仪器有限公司）；培养皿、培养瓶（25cm2）；倒置光学显微镜（Nikon，TS100）；离心机（上海安亭科学仪器，TDL－5－A）；酶标仪（奥地利-瑞士帝肯公司，DNM－9602）。

2 实验方法

2.1 药液的制备

取地梢瓜果实5kg，干燥粉碎后以体积分数75%乙醇回流提取3次（每次2倍量，提取2h），合并提取液，回收溶剂，干燥得浸膏994g。将浸膏混悬于水中（2倍量），分别以等体积的石油醚（bp30℃－60℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取各3次，回收溶剂得石油醚浸膏505g、乙酸乙酯浸膏408g、正丁醇浸膏81g。地梢瓜乙醇提取物取1.2107g加入50ml锥形瓶中，以分子量为500得出加入24ml二甲基亚砜溶解，浓度为0.0504g/ml。地梢瓜石油醚提取物取1.4362g加入50ml锥形瓶中，以分子量为500得出加入28ml二甲基亚砜溶解，浓度为0.0522g/ml。地梢瓜乙酸乙酯提取物取0.5341g加入50ml锥形瓶中，以分子量为500得出加入18ml二甲基亚砜溶解，浓度为0.0501g/ml。正丁醇提取物取0.9020g加入50ml锥形瓶中，以分子量为500得出加入10ml二甲基亚砜溶解，浓度为0.0534g/ml。二甲基亚砜溶解物各取1ml过滤于15ml离心管中，再加入9ml培养液，最终浓度为5μg/ml备用。

2.2 细胞复苏与造模

在超净台中无菌操作，将冻存管内的细胞移入15ml离心管中离心，1000rpm/5min。弃去上清，加5ml培养基，吹吸混匀，用移液枪吸到培养瓶中，放入37℃、饱和湿度5%CO2细胞培养箱中培养，隔天换液。细胞呈对数生长期时，将细胞传到96孔板，正常组加入培养液，其余组加入相同20μg/ml浓度的LPS[7]。

2.3 加药与分组

模型成功后，将96孔板中的液体弃去，分为正常组、模型组、地梢瓜石油醚提取物组、地梢瓜乙醇物组、地梢瓜正丁醇物组、地梢瓜乙酸乙酯物组，每组设12个复孔，正常组加培养液，模型组加20μg/ml浓度的LPS，地梢瓜石油醚提取物组加5μg/ml的石油醚提取物、地梢瓜乙醇物组加5μg/ml的乙醇提取物、地梢瓜正丁醇物组加5μg/ml的正丁醇提取物、地梢瓜乙酸乙酯物组加5μg/ml的乙酸乙酯提取物，继续培养24h。

2.4 检测指标

镜下观察细胞生长情况，MTT法检测细胞活力，ELISA方法检测IL-8和TNF-α的含量。

2.5 统计学分析

3 结果

3.1 MTT检测结果

MTT检测结果显示，模型组与正常组比较OD值显著低（P＜0.05）；培养24h时乙酸乙酯组和正丁醇组与模型组，比较OD值显著高（P＜0.05）。培养48h时4组加药组的与模型组比较OD值显著增高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组细胞MTT法OD值（±s，n=12）

表1 各组细胞MTT法OD值（±s，n=12）

注：与正常组比较*P＜0.05，与模型组比较＃P＜0.05

组别 24h 48h正常组 0.43±0.01 0.63±0.01模型组 0.20±0.01* 0.19±0.01*地梢瓜乙酸乙酯组 0.33±0.03＃ 0.54±0.04＃地梢瓜石油醚组 0.21±0.05 0.43±0.13＃地梢瓜正丁醇组 0.37±0.04＃ 0.59±0.03＃地梢瓜乙醇组 0.25±0.02 0.43±0.02＃

3.2 ElISA法检测结果

ELISA法检测结果显示，TNF-α OD值模型组与正常组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）；培养24h时乙酸乙酯组和正丁醇组与模型组比较OD值显著降低。差异具有统计学意义（P＜0.05）。IL-8 OD值模型组与正常组比较显著增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；培养24h时乙酸乙酯组和正丁醇组与模型组比较OD值显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

4 讨论

人正常结肠上皮细胞（NCM460）是体外研究中常用的研究肠粘膜上皮的细胞模型，肠上皮细胞在肠腔内的分布位置以及其生理功能决定了其在粘膜屏障中具有关键作用。

蒙药地梢瓜是蒙医临床从古至今一直使用的止泻药，前期研究已发现对肠粘膜有保护作用[8]。从实验结果来看，地梢瓜乙酸乙酯和正丁醇萃取部位对LPS诱导NCM460细胞损伤有一定修复作用。LPS诱导NCM460细胞后，IL-8、TNF-α炎性因子的表达明显升高，加地梢瓜提取物后对炎性因子有明显的抑制作用。这说明地梢瓜对NCM460细胞损伤有修复作用，给临床上应用地梢瓜药物对结肠上皮细胞修复提供了理论依据，但具体机制有待进一步研究。