两种造模方法致大鼠慢性肾病模型的肾功能及病理变化比较

李天祎 杨 扬 杨素萍 李嘉琦 马逸群 王家平

慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，CKD)是影响全球公共健康的主要疾病之一，全球发生率约为8%～16%[1]。临床多表现为蛋白尿、低蛋白血症、水肿以及高脂血症等。因CKD发生率逐渐增高，病程迁延，很难治愈，末期多发展为慢性肾衰竭，只能依靠透析、换肾等仅有的治疗方式缓解，已经逐渐成为威胁人类健康的一类慢性疾病。随着人们对慢性肾病发病机制和病理变化等研究的深入，建立慢性肾病动物模型对研究CKD的肾组织病理形态学变化以及探究治疗CKD的新方法有着重要的意义。

目前，国内外公认的模拟慢性肾病效果较好的为阿霉素(adriamycin，ADR)大鼠模型。ADR在大鼠体内代谢较为缓慢，对心脏、肝脏、骨髓、胃肠等具有较强的不良反应，但经尾静脉注射后，其毒性可主要积累于肾脏[2]。因此，应用ADR造模时，应注意注射的方式、剂量等。近年来，应用较为广泛的方法主要有尾静脉注射法(单次或多次)、单侧肾切除+重复尾静脉注射ADR和肾动脉注射法等。本研究比较单侧肾切除+重复尾静脉注射ADR及二次尾静脉注射ADR这两种方法，旨在为更好地复制慢性肾病模型提供更加丰富的参考依据。

材料与方法

1.实验材料：(1)实验动物：雄性SD大鼠，18只，体质量150～200g，购自昆明医科大学实验动物中心，保证动物在室温下正常饲养。(2)主要试剂：阿霉素(ADR)购自美国Sigma公司，医用缝线、一次性无菌巾、75%乙醇、医用纱布等购自杭州华威医疗用品。

2.实验方法：(1)大鼠造模：将18只SD大鼠随机分为3组，即N组、A组和B组。N组为正常对照组(n=6)。A组为单侧肾脏切除+重复尾静脉注射ADR(n=6)，将大鼠10%水合氯醛麻醉后，取俯卧位固定于超净台，选取左侧肋嵴角为手术切口，逐层剥离皮肤、皮下脂肪及肌肉组织后，将左侧肾蒂剥离，用手术缝线进行结扎，切除肾脏，缝合手术切口后消毒，术后以3mg/kg阿霉素经大鼠尾静脉注射，将大鼠归笼正常饲养，并于14天后再次尾静脉注射ADR(3mg/kg)1次。B组以3mg/kg ADR分两次经尾静脉注射(n=6)，两次间隔14天注射。

3.观察指标：(1)一般情况：观察各组大鼠的精神状态、毛色、体质量变化等一般情况，有无水肿，腹腔积液或瘫痪等。(2)大鼠肾功能检测：注射后第4、8、12周，将大鼠用乙醚麻醉后采用内眦采血法，3000r/min离心20min，分离血清。日本日立7170A型全自动生化分析仪检测血尿素氮、血肌酐、血清白蛋白，各组标本均在笔者医院检验科完成。(3)肾组织病理形态学观察：于第12周末处死各组大鼠，取出右肾，快速剥离肾包膜，放置在10%甲醛溶液中固定，脱水、透明、石蜡包埋后，切片(厚约3μm)，作苏木精-伊红(HE)染色，在光镜下观察并摄片。

4.统计学方法：采用IBM SPSS 21.0统计学软件对数据进行统计分析，计量资料多组间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.一般情况：N组大鼠活动灵便，状态良好，毛色顺滑。A、B组两组大鼠状态较差，部分大鼠伴有毛发脱落，活跃欠佳，饮食量有不同程度减少，均出现不同程度水肿，毛色黯淡、微黄，精神不振，部分大鼠伴有腹腔积液，其中A组比B组变化更为明显。

2.各组肾功能变化：与N组比较，A、B两组大鼠血肌酐、血尿素氮升高，并表现为低蛋白血症。血尿素氮(BUN)值：8、12周末，A组尿素氮即出现上升(P<0.05)，B组在12周末尿素氮上升较为明显(P<0.05)；血肌酐(Cr)值：A、B组血肌酐在8周末及12周末较4周时均有明显上升(P<0.05)；白蛋白值：A、B组较N组均有降低，在8周时A组下降较为明显(P<0.05，表1，图1)。

表1 各组大鼠肾功能及白蛋白比较

图1 各组大鼠肾功能及白蛋白比较与A组比较，*P<0.05

3.肾组织病理学改变：肉眼观察：12周末A组肾脏体积明显增大，表面凹凸不平，呈弥漫性颗粒状改变，色泽呈黄褐色改变；B组肾脏包膜紧张，表面尚光滑，色偏黄褐。光镜下观察：N组大鼠的肾小球、肾小管和肾间质未见明显异常改变；A组肾脏的肾小球出现萎缩，硬化，局部肾小球毛细血管袢扩张淤血，肾小管结构紊乱，上皮细胞可见空泡样变性，腔内可见蛋白管型，并且肾间质内大量炎性细胞浸润，受损程度和灶性病变范围较B组加重；B组大鼠的肾组织切片显示，肾脏近曲、远曲小管、髓袢和集合管上皮可见不同程度水肿变性，部分管腔扩张，腔内可见少量透明管型，部分肾小球有轻微的萎缩，肾间质内可见少量轻-中度淋巴细胞和浆细胞浸润的炎性反应(图2)。

图2 各组大鼠肾组织HE染色结果(×20)A.N组；B.A组；C.B组

讨 论

阿霉素(ADR)，又名多柔比星，做为一种蒽环类抗生素，在临床中广泛应用于多种癌症的治疗[3]。其导致肾脏损伤的发病机制主要有3个方面：①ADR抑制大鼠肾脏的自噬过程，造成肌动蛋白细胞骨架损伤，足细胞足突消失[4]；②ADR可以诱导肾小球上皮细胞过氧化反应，造成肾小球滤过膜完整性被破坏，导致滤过屏障受损而形成持续蛋白尿；③ADR能激活多种炎性介质，促进系膜细胞增殖，随着病程迁延逐渐发展导致肾小球硬化[5]。全球首次报道阿霉素肾病在20世纪80年代初，近年来，在使用阿霉素造模过程中，对于用法与用量仍存在分歧和争议。因较大剂量会使大鼠出现心力衰竭、免疫力下降甚至死亡，而减少剂量则使造模时间延长，大鼠肾脏损伤达不到造模标准，所以对于阿霉素的应用剂量和造模方法目前仍然无法统一[6]。

目前，较为常用的慢性肾病模型制作方法主要有以下5种：①5/6肾切除[7]；②尾静脉注射阿霉素；③单侧肾切除+尾静脉注射阿霉素[8,9]；④尾静脉注射环孢素；⑤结扎单侧输尿管等方法[10]。研究报道，尾静脉注射ADR法，首次剂量过大易出现大鼠极度狂躁、死亡等情况，尾静脉注射次数过多可能出现阿霉素外渗，造成剂量不足或大鼠尾部溃烂等情况发生[11]。单侧结扎大鼠输尿管的方法在制作模型时，因需要把肾盂输尿管结合部和输尿管膀胱入口处一并结扎，所以手术切口较大，并且找寻输尿管所需时间较长，故造成的手术不良反应较大，且具有易感染等缺陷；5/6肾切除法对于术者要求较高，手术切面过大，出血量也随之增大，病死率较高[12]。根据本实验研究并对比上述造模方法，单侧肾脏切除+二次尾静脉注射ADR法具有以下优势：①手术切口较小，可直接结扎单侧肾蒂，出血量较小，手术时间缩短，可降低大鼠的感染概率，病死率较小；②单侧肾脏切除后阿霉素给药剂量较单次尾静脉注射ADR法小，可降低阿霉素外渗可能，减轻大鼠尾部溃烂；③大鼠造模后，成模所需时间较二次尾静脉注射ADR法更短，且成模效果较好。

本研究比较的两种方法均可制作阿霉素肾病模型。单侧肾脏切除+重复尾静脉注射ADR和两次尾静脉注射ADR法均可使大鼠肾功能发生改变。在各个观察点A、B两组的血肌酐、血尿素氮值比较，差异均有统计学意义，与此同时，两组的肾组织也具有显著的形态学变化。其中A组血肌酐、血尿素氮在第8周时即出现上升，白蛋白也在8周末出现明显下降，且A组大鼠肾脏病理切片显示肾小球出现萎缩，硬化，球囊粘连，局部肾小球毛细血管袢扩张淤血，肾小管上皮细胞可见空泡样变性，腔内可见蛋白管型，并且肾间质内可见大量淋巴细胞和浆细胞浸润。这一结果提示单侧肾切除+重复尾静脉注射阿霉素法发展为慢性肾衰竭的趋势更加明显。产生这一结果的原因可能与单侧肾脏的负荷加重导致代偿功能不足，呈现出肾功能进行性加重，故而更加符合慢性肾衰竭的表现，其肾脏的病理学改变也证明了这一点[13]。

近年来，阿霉素大鼠模型因其能更好地复制人类慢性肾病表现而得到了广泛的研究与应用，ADR可诱导肾小球内皮变薄和足细胞消失，这与血浆蛋白过滤的大小和电荷特异性屏障的丧失有关[14]。其动物模型的组织学变化与人类局灶性肾小球硬化相似，伴有足细胞融合、局灶节段性和肾小球硬化以及肾小管间质炎症和纤维化，并且大鼠表现出来的血清肌酐升高、肌酐清除率降低、血清白蛋白降低、血脂异常和尿蛋白排泄增加，与肾病综合征和CKD一致[15]。本研究的不足之处在于观察时间仅到12周，无法观察12周之后的肾功能变化趋势，除此之外在应用阿霉素过程中，由于实验大鼠的批次、药物敏感度和遗传变异等方面会对大鼠的肾功能产生一定的影响，因此如何使大鼠肾脏损伤趋于稳定还需进一步研究。