CD90作为卵巢癌干细胞标志物的相关研究

翁艳洁 周晓水 王常玉 项 涛

卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发生率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而位居第 3 位，但病死率却位居各类妇科肿瘤的首位。化疗耐药、肿瘤复发及转移是卵巢癌预后不良的关键因素，肿瘤干细胞在其中起重要作用[1]。卵巢癌也被认为是肿瘤干细胞导致的疾病[2]。研究卵巢癌干细胞具有重要的科研价值和临床意义[3]。目前卵巢癌干细胞的识别和分离大多采用肿瘤干细胞标志物的方法，例如 CD44、CD133、CD117、CD24、ALDH1或 MyD88等，可能与肿瘤干细胞的异质性有关[4～8]。卵巢癌中CD90也可能是一种十分重要的肿瘤干细胞标志物[9]。笔者将对 CD90 是否可作为卵巢癌干细胞筛选的分子靶标进行分析，研究 CD90+卵巢癌细胞是否具有肿瘤干细胞的干性特征。

材料与方法

1.细胞培养：人卵巢癌顺铂耐药细胞 SKOV3-MD3 的制备：向5～6周龄雌性裸鼠腿部注射 SKOV3 细胞1×106/100μl，7天后腹腔注射3mg/kg的顺铂(美国Sigma公司)，每3天1次，共治疗8次后处死小鼠，取出瘤块，消化成单细胞再次打入其他小鼠腿部，重复上述实验 2 次，得到 SKOV3-MD3 顺铂耐药株。

人卵巢癌细胞株 SKOV3 购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)。SKOV3及SKOV3-MD3以含10% (质量分数)胎牛血清的 RPMI 1640 培养基(美国Gibco公司)于5%CO2、37℃、95% 湿度条件下孵箱中常规贴壁培养，3～4天传代1次。

CD90+卵巢癌细胞用无血清的 DMEM/F12(1∶1)(美国Gibco公司) 培养，其中添加20ng/ml EGF(美国PeproTech公司)、10ng/ml bFGF(美国PeproTech公司)、5μg/ml 胰岛素(美国Sigma公司)、B27(1∶50)(美国Invitrogen 公司)、LIF 10ng/ml(美国Millipore公司)。

2.CD90+细胞和 CD90-细胞分选：收集贴壁培养的 SKOV3-MD 细胞，预冷 PBS 冲洗 2 次后加入 FITC 标记鼠抗人 CD90 抗体(美国BD公司)，37 ℃孵育1h。预冷PBS冲洗2次，采用BD FACSAria Ⅱ流式分选仪对CD90+和 CD90-细胞进行分选。

3.自我更新能力鉴定：体外悬浮球形成能力：分别将上述分选获得的CD90+和 CD90-两组细胞用干细胞培养基 DMEM/F12(1∶1)(美国Gibco公司) 悬浮培养，其中添加20ng/ml EGF(美国PeproTech公司)、10ng/ml bFGF(美国PeproTech 公司)、5μg/ml胰岛素(美国Sigma公司)、B27(1∶50)(美国Invitrogen 公司)、LIF 10ng/ml(美国Millipore公司)进行有限稀释，保证10 个细胞/毫升的浓度，种入 96 孔低黏附孔板中(每孔200μl)，在显微镜下标注仅有1个细胞的孔，共培养14天，比较 CD90+和 CD90-细胞悬浮球形成的比例以及成球大小。

4.RT-PCR 检测干细胞标志物表达：分别提取CD90+和CD90-细胞总 RNA，3μg RNA 合成 cDNA。反应条件：95℃ 5min；94℃ 1min；56℃ 30s；72℃ 30s 30个循环,72℃延伸10min。引物：Nestin上游引物：5′-AGCCCAACGTACACCCCGAT-3′，下游引物：5′-CCCCAGAACCCAACTCCTCC-3′；Sox2上游引物：5′-TACCTCTTCCTCCCACTCCA-3′，下游引物：5′-GGTAGTGCTGGGACATGTGA-3′；GAPDH上游引物：5′-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游引物：5′-TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3′。引物均由上海英骏生物有限公司合成。运用Chemi Imager 5500软件对各条带进行灰度分析, 以各基因和GAPDH积分灰度值的比值作为相对表达量，比较各基因 mRNA 水平表达情况。

5.动物成瘤实验：人卵巢癌非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠皮下移植瘤模型的建立: 每只 NOD/SCID 雌性小鼠(年龄5周)接种的细胞数量：CD90+和CD90-细胞分别为100、1000、10000个/只。每组细胞用50μl PBS稀释，与等体积Matrigel混合均匀。在小鼠左侧面淋巴结处皮下各注射100μl细胞悬液，次日记为接种第1天。注射后每天换垫料，每周观察1次肿瘤形成及接种部位有无红肿、溃破。记录3个月以内的皮下成瘤情况和动物生存状况。实验动物由上海市肿瘤研究所实验病理中心提供。小鼠随机分组，每组 6 只小鼠。

结 果

1.人卵巢癌细胞SKOV3-MD3中CD90+细胞比例：流式细胞仪鉴定人卵巢癌细胞SKOV3-MD3中CD90+比例为5.3%±0.9%，详见图1。

图1 SKOV3-MD3中CD90+细胞比例

2.CD90+细胞自我更新能力高于CD90-细胞：单个CD90+细胞有分裂能力，可以在7天形成悬浮克隆球，并且可以连续传代3次，说明CD90+细胞具有自我更新能力。单个 CD90-细胞增殖能力较慢，14天形成较小的悬浮克隆球，说明有一定的分裂能力。单个CD90+细胞和 CD90-细胞悬浮球形成率分别为68.0%±6.3%和18.0%±4.5%，差异有统计学意义(t=11.22，P<0.01，图2)。

图2 单个CD90+细胞和CD90-细胞自我更新能力A.单个CD90+细胞和CD90-细胞悬浮球形成率；B、C分别为单个CD90+ 细胞和CD90-细胞体外悬浮球图片(×200)

3.CD90+细胞体外分化潜能高于CD90-细胞：分别将CD90+细胞和CD90-细胞形成的悬浮克隆球细胞体外培养，用CD90单克隆抗体对细胞染色，流式细胞仪再次鉴定两组悬浮克隆球中CD90+细胞和CD90-细胞的比例。结果显示，单个CD90+细胞形成的克隆球细胞中含有CD90+和CD90-两种细胞，说明单个CD90+细胞可以分化形成CD90+细胞和CD90-细胞，具有分化潜能。单个CD90-细胞形成的克隆球细胞中只含有CD90-细胞，无分化潜能，详见图3。

图3 CD90+细胞和CD90-细胞分化潜能鉴定A、C.对照组细胞；B、D.CD90单抗染色细胞；A、B.CD90+ 克隆球细胞；C、D.CD90-克隆球细胞

4.CD90+细胞和CD90-细胞在 RNA 水平干细胞标志物的相对表达水平：T-PCR 结果显示，在 RNA 水平，CD90+细胞表达干细胞标志物 Nestin和 Sox 2均明显高于CD90-细胞，差异有统计学意义(tNestin=7.12,tSox 2=7.07,P<0.01)，详见图4。

图4 CD90+细胞和CD90-细胞干性标志物相对表达

5.CD90+细胞在NOD/SCID 小鼠形成皮下移植瘤的能力高于CD90-细胞：体内实验显示，CD90+细胞最低成瘤数是100个细胞，成瘤时间是8周。CD90-细胞组最低成瘤细胞数 1×104个细胞，成瘤时间是8周，详见表1。CD90+与CD90-细胞成瘤能力存在明显的指数级差异，且差异有统计学意义(t100=3.26，t1000=6.51，t10000=12.20，P<0.05)。

表1 CD90+细胞和CD90-细胞在NOD/SCID小鼠中皮下成瘤能力

讨 论

卵巢癌5年生存率仅30%左右，严重威胁广大女性的健康[10～12]。卵巢癌中以上皮性癌最多见，而浆液性癌是最常见的上皮性卵巢癌。高级别浆液性腺癌是病死率最高的类型，肿瘤的转移、复发及化疗耐药是其预后不良的主要因素。

肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)也称为肿瘤起始细胞(tumor initiating cell, TIC)，是肿瘤中具有自我更新和多向分化潜能的一种癌细胞亚群，与肿瘤的复发与耐药密切相关。Hamburger 等在 1977 年证实了卵巢癌干细胞(ovarian cancer stem cells，OCSC)的存在。由于卵巢癌病理类型复杂，目前分选卵巢癌干细胞的细胞表面标志尚无统一报道，最常见的包括 CD44、CD117、CD133、CD24、ALDH1、MyD88 等。如何识别及获得卵巢癌干细胞仍是研究的重点和难点。笔者既往的研究发现，可通过富集耐药细胞群的方式来筛选卵巢癌干细胞，且发现化疗药物富集的卵巢癌细胞SKOV3-MD3较SKOV3细胞不仅对顺铂的耐药性增加，还高表达CD90，提示CD90可能是卵巢癌干细胞筛选的分子学标志物之一。

CD90是一个25～37 kDa膜表面锚定蛋白，在骨髓来源的间质干细胞、肝癌干细胞、造血干细胞、角化干细胞、乳腺癌干细胞、胃癌干细胞及脑胶质瘤干细胞中均有表达[13～18]。有研究报道证实，CD90+SKOV3卵巢癌细胞的干细胞标志物CD44、CD133、ALDH1、Nanog及Oct4表达水平均明显高于CD90-细胞；CD90+细胞能够促进卵巢癌细胞腹腔播散[5，6]。有研究报道，CD90+SKOV3细胞表达干细胞标志物CD44、CD133、ALDH1、Nanog 及Oct4 均明显高于CD90-SKOV3细胞[10,11]。但CD90是否可以作为卵巢癌干细胞筛选的分子学标志物仍需要进一步提供理论证据。为了更好地获得卵巢癌干细胞，本实验室通过顺铂药物动物体内富集的方法获得了人卵巢癌顺铂耐药细胞株 SKOV3-MD3。

本研究进一步发现，单个CD90+SKOV3-MD3卵巢癌细胞在体外培养7天可以形成克隆球，且可以连续传代3次，说明CD90+卵巢癌细胞具有自我更新能力；将单个CD90+形成的克隆球细胞分析后发现，单个CD90+卵巢癌细胞可以再次分化出CD90+和CD90-细胞，说明 CD90+细胞具有分化能力，而CD90-卵巢癌细胞没有分化能力；CD90+卵巢癌细胞高表达干细胞标志物CD44、CD133、ALDH1、Nanog、Oct4、Nestin和Sox。在NOD/SCID小鼠皮下移植瘤实验中，100个CD90+卵巢癌SKOV3-MD3可以在 8 周形成肿瘤，表现出较高的体内成瘤能力；10000个CD90-SKOV3-MD3 细胞只有1只小鼠可以皮下成瘤。动物实验结果提示，CD90+卵巢癌细胞与CD90-卵巢癌细胞在成瘤能力中具有显著的指数级差异，差异有统计学意义。综合上述所有结果可知，CD90+卵巢癌细胞具有干细胞特性，CD90可能是卵巢癌干细胞的分子学标志物。

综上所述，通过分析CD90+卵巢癌细胞的干性特征，不仅进一步证实了 CD90在分选卵巢癌干细胞中的可行性以及卵巢癌干细胞的异质性，还有利于深入研究卵巢癌的分子分型及卵巢癌细胞的耐药性及侵袭转移等恶性生物学特性[19]，对于揭示卵巢癌的耐药机制，寻找新的分子干预靶点具有十分重要的研究价值。