上调lncRNA CTA-246H3.12通过调节miR-515-5p抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭

常昆鹏 魏珍星 李 斐 张 炜

鼻咽癌是临床较多见的恶性肿瘤之一，与EB病毒感染有关，男性的发生率是女性的2倍[1]。近年来，对鼻咽癌的诊治手段有了显著进步，然而鼻咽癌的易复发和易转移导致部分患者的预后仍不理想[2]。早期发现、治疗及监测复发、转移对鼻咽癌患者的预后具有重要的临床意义。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度超过200nt的非编码RNA分子，位于细胞核或胞质内，长期以来被认为是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，并不具有生物学功能[3]。近年来研究表明，lncRNA参与基因组印记、转录激活、核内运输等各种生理过程, 与鼻咽癌、肺癌、肝癌等多种肿瘤的发生及发展密切相关[4～6]。CTA-246H3.12全长747nt，是一种新发现的lncRNA，但CTA-246H3.12在疾病方面特别是鼻咽癌的研究鲜有报道。本研究通过检测鼻咽癌组织和细胞系中CTA-246H3.12的表达水平, 进一步分析上调CTA-246H3.12影响鼻咽癌细胞增殖和侵袭的分子机制。

材料与方法

1.组织标本、细胞系和主要试剂：收集2016年9月～2018年7月笔者医院耳鼻喉科33例活检切除鼻咽癌组织，其中男性18例，女性15例，患者年龄31～54岁，平均年龄47.28±7.26岁。按照鼻咽癌WHO 病理分型(2005)版进行分型，角化癌13例，非角化性癌20例。按照美国癌症联合委员会鼻咽癌TNM分期系统(2010年第7版)对鼻咽癌患者进行分期，其中Ⅰ期7例，Ⅱ期15例，Ⅲ期11例。选取2017年8月～2018年5月33例慢性鼻咽炎患者的鼻咽黏膜组织作为对照。本研究经笔者医院医学伦理学委员会批准，患者均签署知情同意书，所有患者均未行术前放疗和化疗，所有标本经术后两名以上病理科医生确诊。鼻咽癌细胞系(CNE-2Z、HONE-1、HNE-1、SUNE-1、C666-1) 和人永生化鼻咽上皮细胞(NP69)购自中国典型培养物保藏中心，RPMI 1640培养基、K-SFM培养基培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司，qPCR试剂盒购自美国Roche公司，携有无意义序列的阴性对照质粒和携有CTA-246H3.12的质粒购自上海吉玛制药有限公司，Transwell小室购自美国Corning公司，四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒购自美国Sigma公司，LipofectamineTM2000和Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，抗体购自美国CST公司。

2.细胞培养和转染：鼻咽癌细胞系(CNE-2Z、HONE-1、HNE-1、SUNE-1、C666-1)用RPMI 1640(含10%胎牛血清)培养基常规培养，人永生化鼻咽上皮细胞(NP69)用K-SFM(含10%胎牛血清)培养基常规培养，均培养于37℃、5%CO2培养箱，隔天传代，取对数生长期细胞进行转染。以对数生长期的C666-1细胞进行转染，以携有无意义序列的阴性对照质粒作为阴性对照组，以携有CTA-246H3.12的质粒作为CTA-246H3.12组，根据LipofectamineTM2000说明书进行转染操作，隔天换液。

3.qPCR检测：使用Trizol法提取组织或细胞总RNA，反转录为cDNA后，根据qPCR试剂盒说明书进行操作。每个样本设4个复孔，以GAPDH为内参检测CTA-246H3.12和CDX1 mRNA的表达，以U6为内参检测miR-515-5p的表达。反应条件为96℃ 10min、95℃ 10s、62℃ 40s、72℃ 40s，40个循环。以2-ΔΔCt法计算CTA-246H3.12、miR-515-5p和CDX1 mRNA的相对表达。qPCR引物如下：CTA-246H3.12上游引物：5′-CCCAATCACACAGACATTGC-3′，下游引物：5′-TGGGGACCTCATCAACATTT-3′；CDX1上游引物：5′-GGTGGCAGCGGTAAGACTC-3′，下游引物：5′-TGTAACGGCTGTAATGAAACTCC-3′；GAPDH上游引物：5′-CTGTGGGAGCGAATCGAGG-3′，下游引物：5′-CAGCGCAAGATGTCCATCA-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-515-5p上游引物：5′-GGGTTCTCCAAAAGAAAGCAC-3′，下游引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。

4.MTT法：细胞转染后48h，将两组细胞分别以每孔2000个接种于96孔板，分别在第1、2、3、4、5天进行MTT法测量。每孔加入10μl MTT溶液，在孵箱内培养4h，除去孔内气泡，采用酶标仪检测450nm波长处的吸光度值，每组4个复孔。

5.Transwell侵袭实验：将RPMI 1640培养基与Matrigel基质胶以1∶10的比例混合，每个小室上室加入100μl，置于培养箱中凝固。细胞转染后48h，将两组分别消化，用RPMI 1640培养基重悬并计数。在上室加入200μl细胞悬液(2×104个细胞)，在下室加入600μl完全培养基。培养箱培养24h，取出上室，固定、染色、计数。

6.生物信息学方法：根据LncBase Predicted v.2预测网站分析CTA-246H3.12的靶向miRNA，根据miRWalk2.0预测网站分析miRNA的靶向基因。

7.Western blot法检测：细胞转染后48h，将两组细胞裂解并提取总蛋白，按50μg蛋白上样进行10%聚丙烯酰氨凝胶电泳，转膜后使用5%脱脂奶粉封闭，分别与一抗在4℃下孵育过夜，与二抗孵育后，滴加化学发光试剂，采用凝胶成像系统扫描、拍照。

结 果

1.CTA-246H3.12在鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织中的表达：与慢性鼻咽炎组织比较，CTA-246H3.12在鼻咽癌组织中表达下调(P<0.01，图1)。

图1 CTA-246H3.12在鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织中的表达

2.CTA-246H3.12在正常鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞系的表达：与人永生化鼻咽上皮细胞(NP69)比较，CTA-246H3.12在鼻咽癌细胞系(CNE-2Z、HONE-1、HNE-1、SUNE-1、C666-1)中表达下调(P<0.05)，C666-1细胞中CTA-246H3.12的表达量最低(P<0.01，图2)。

图2 CTA-246H3.12在人永生化鼻咽上皮细胞和鼻咽癌细胞系中的表达与NP69细胞比较，*P<0.05，**P<0.01

3.CTA-246H3.12质粒的转染效率：阴性对照组和CTA-246H3.12组C666-1细胞中CTA-246H3.12相对表达量分别为1.07±0.22和11.43±0.96(P<0.01)，质粒转染成功。

4.上调CTA-246H3.12对C666-1细胞增殖的影响：MTT检测结果显示，与阴性对照组比较，CTA-246H3.12组的C666-1细胞从第3天起，增殖能力降低(P<0.05，图3)。

图3 CTA-246H3.12对鼻咽癌细胞C666-1增殖的影响与阴性对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

5.上调CTA-246H3.12对C666-1细胞侵袭的影响：阴性对照组和CTA-246H3.12组C666-1细胞侵袭细胞计数分别为81.62±4.59和38.01±7.27(P<0.01，图4)。与阴性对照组比较，转染CTA-246H3.12后的鼻咽癌细胞侵袭能力被抑制。

图4 CTA-246H3.12对鼻咽癌细胞C666-1侵袭的影响

6.生物信息学方法预测结果：如图5所示，LncBase Predicted v.2预测网站分析CTA-246H3.12的靶向miRNA是miR-515-5p，miRWalk2.0预测网站分析miR-515-5p的靶向基因是CDX1。

图5 生物信息学方法预测CTA-246H3.12的靶基因

7.两组细胞中miR-515-5p、CDX1 mRNA的表达：阴性对照组和CTA-246H3.12组C666-1细胞中miR-515-5p相对表达量分别为1.02±0.12和0.25±0.03(t=6.45，P<0.01)。与阴性对照组比较，CTA-246H3.12组细胞中miR-515-5p的表达降低。阴性对照组和CTA-246H3.12组C666-1细胞中CDX1 mRNA相对表达量分别为1.07±0.22和7.04±0.81(t=7.08，P<0.01)。与阴性对照组比较，CTA-246H3.12组细胞中CDX1 mRNA的表达增加。

8.上调CTA-246H3.12对CDX1蛋白及下游蛋白表达的影响：Western blot法结果显示，与阴性对照组比较，转染CTA-246H3.12后，CDX1蛋白表达增加，细胞周期相关蛋白Cyclin H、CDK7蛋白的表达明显降低，细胞侵袭相关蛋白Twist2、Slug的表达明显降低(图6)。

图6 Western blot法检测 CTA-246H3.12对CDX1蛋白表达的影响

讨 论

寻找新的鼻咽癌生长和转移的分子靶点，是临床鼻咽癌的未来治疗的方向[7]。越来越多的研究表明, 长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA，lncRNA)可发挥表观遗传调控、转录水平调控及转录后水平调控的作用，参与疾病的发生和发展[8]。lncRNA对鼻咽癌细胞增殖和转移行为的影响受到广泛的关注[9]。lncRNA如THOR、HOTAIR、LINC00460、C22orf32-1、ANRIL等对鼻咽癌的增殖和转移具有重要的调控作用，与鼻咽癌患者的预后相关，可能参与鼻咽癌的发生和发展[2, 4～6, 10]。CTA-246H3.12是一种新发现的lncRNA，其在疾病特别是鼻咽癌中的分子机制尚不明确。

本研究发现，CTA-246H3.12在鼻咽癌组织和细胞系中表达下调，表明CTA-246H3.12可能在鼻咽癌的发生和发展中发挥调控作用。MTT法和Transwell侵袭实验显示，上调CTA-246H3.12可抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭。近年来研究表明，lncRNA可作为竞争性内源RNA，特异性地与miRNA 结合，下调miRNA的活性，从而间接上调miRNA靶基因的表达[11, 12]。生物信息学方法显示，CTA-246H3.12的靶基因可能是miR-515-5p，miR-515-5p的靶基因可能是尾侧型同源盒转录因子1(CDX1)。CDX1属于CDX家族的成员之一，最初被发现具有调控胚胎发育的作用，参与调控肠上皮细胞的分化和维持肠上皮结构[13]。近年来研究表明，CDX1在胃癌、乳腺癌、结直肠癌等多种肿瘤组织中表达缺失，与肿瘤的增殖、迁移和侵袭行为的获得呈负相关[14, 15]。高表达CDX1可抑制肿瘤的生长和转移，CDX1发挥抑癌基因的作用。本研究发现，上调CTA-246H3.12的C666-1细胞中miR-515-5p的表达降低，CDX1mRNA的表达增加，下调miR-515-5p的活性，从而间接上调miR-515-5p靶基因CDX1的表达。CDX1表达表达上调后，细胞周期相关蛋白Cyclin H、CDK7蛋白的表达明显降低，细胞侵袭相关蛋白Twist2、Slug的表达明显降低，表明鼻咽癌C666-1细胞的增殖和侵袭能力降低。

综上所述，CTA-246H3.12在鼻咽癌组织和细胞系中表达降低，上调CTA-246H3.12可抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭，其分子机制可能是通过抑制miR-515-5p的表达，间接促进CDX1基因的表达。CTA-246H3.12在鼻咽癌的发展中可能发挥抑癌基因作用，为今后鼻咽癌的治疗提供新的潜在治疗靶点。