代谢组学在结直肠癌中西医诊疗应用的研究进展

尚芳，裴斌，周伟康，樊志敏

(1.南京中医药大学，江苏 南京 210000；2.南京市中医院，江苏 南京 210000)

0 引言

近年来，随着人民生活水平的提高和饮食结构的改变，结直肠癌(colorectal cancer，CRC)在我国的发病率逐年上升[1]。手术治疗是目前治疗CRC的首选方法，但面临创伤大、风险高等问题，对患者而言恢复周期长，经济压力大。同时，与早期患者相比中晚期患者预后较差。因此，结直肠癌的早发现、早治疗尤为重要。恶性肿瘤是由多种因素共同作用造成机体功能紊乱的复杂疾病，其组织与人体正常组织在代谢方面有着显著差异。代谢组学 (metabonomics/metabolomics) 通过生物体内代谢物进行系统定量分析的方法，寻找出代谢物与生理、病理之间的对应关系。其研究方法非常类似于我国传统中医司外揣内、见微知著的诊疗思想。辨证论治是中医的核心内容，更是临床诊疗的基础。代谢组学从微观视角通过生物体代谢物能够对生物体所患疾病得出诊断，从而可以为预后治疗情况、临床治疗情况提供更多有效评价依据。中医辩证论治则是从宏观视角，指导临床思维，二者相辅相成。现将近年来代谢组学在CRC中西医诊疗中的应用综述如下。

1 代谢组学简介

1.1 代谢组学的背景和定义

1998年Tweeddale等在研究大肠杆菌的代谢时首次提出代谢组(Metabolome)这一概念，并提出“代谢物组成分析能够提供有关细胞代谢和调控的重要信息”。1999年，Nicholson[2]等在近二十年生物代谢系统研究的基础上提出了代谢组学的定义，其解释为“对生物体病因或基因改变等情况下代谢参数的定量研究”。国内外学者对代谢组学的解释可概括为：所谓的代谢组学可以简单理解为：生命个体对机体内外环境作出的代谢应答，通多定量方法对应答全貌、动态进行测定的学科[3]。

1.2 代谢组学的研究方法及特点

代谢组学的研究对象是相对分子质量小于1000的小分子代谢物质，包括糖、氨基酸、脂质等。代谢组学融合了包括化学计量学、生物信息学在内的多种研究方法[4]。相较于基因组学和蛋白质组学，代谢组学具有以下特点：(1)检测样本容易获取，且采集样本过程中对人体伤害较小；(2)检测指标远比基因和蛋白质少很多，检测方法简单易行；(3)代谢组学可以为药理研究、病理生理提供动态信息；(4)代谢组学将生物体看作动态的整体，研究内外因素变化时对这一整体的代谢影响，进而揭示生化途径[4,5]。

目前代谢组学已成为疾病研究的新工具，为疾病的认识提供了新视角，广泛用于各个系统疾病相关标志物的发现[6,7]，且在对心脏病[8,9]、糖尿病[10,11]、肿瘤[12,13]、阿尔兹海默症[14,15]的研究中取得了进展。不仅推动了疾病识别与治疗进程，同时也可以为新药测试、精准治疗提供更多参考和依据[16]。

代谢组学研究过程基本上分为如下几个步骤：

第一，制备相关样品。需要将研究对象导入到刺激环境中，比如：改变其基因组，剔除某些基因链或导入新基因，这样可以观察转录水平、蛋白质水平的参数变化，也可以从环境因素入手，观察基因转录的情况。

第二，采集样本并进行预处理，样本采集内容有很多，如：研究对象的血液、尿液、组织细胞等，甚至也可以将整个生物体视为样本。在实验活动中需要兼顾到收集样本时间，样本种类、群体分布等因素，这些都会影响到后续分析。

第三，分析代谢物。一般是通过定量分析手段对采集数据进行分析，定量分析方法主要有核磁共振、质谱、色谱等等，依托更多信息技术平台可以分析出样本类型、含量及变化情况，从而构建代谢组数据。当前最常用的分析技术主要是核磁共振、质谱技术。这些分析方法基本上可以划分为3大类。比如：色谱-质谱联仪分析方法又细分为包括液相色谱-质谱联仪(LC/MS)、气相色谱-质谱联仪(GC/MS)、毛细管电泳-质谱(CE/MS)等，其中：对于分离高挥发性混合物可以采取 GC-MS 方法，对于分离低挥发性混合物可以采取LC-MS方法[17]。不同方法其优势及劣势均不同，为此在代谢组研究分析中常常会将二三种方法联合使用。

第四，分析数据，完成了代谢组数据分析之后，需要对数据进行计量分析，方法有很多，一类是非监督分析，如：主成分分析(PCA) 、非线形映射(NLM) 、聚类分析(HCA) 等；一类是监督分析，如：偏最小二乘法(PLS) 、独立建模分类法(SIMCA) 、人工神经元网络(ANN) 等[18]。最常用的方法是主成分分析法和偏最小二乘法。主成分分析法主要用于对比代谢组之间的区别和相似程度，而偏最小二乘法给出导致区别或相似的贡献变量及其贡献程度。

2 代谢组学在CRC诊疗中的应用

2.1 诊断

机体的正常生理活动需要各个系统平衡协作，如果系统平衡被内部因素或外部因素影响，生理机体代谢就会发生改变，生物体所有的活动都是通过各个系统均衡运行实现的，如果某一系统出现了混乱且没有及时纠正，那么就会引发新问题，积累到一定程度后就会出现宏观性改变，甚至出现病理改变。对于代谢紊乱的问题可以通过尿液或血液检测得出，通过分析代谢情况能够观测出生物体变化情况，从而及早找出诱发疾病的代谢组标志物簇。并了解发病相关的分子机制，就有可能在疾病的早期做到早期诊断和干预。目前临床上CRC的诊断主要依赖内镜下诊断和病理诊断相结合。但结肠镜检查具有侵入性，患者耐受性差，穿孔风险大，且对操作者技术要求较高。代谢组学则很好地弥补了这一缺陷。

许多研究[19-21]表明代谢组学在癌症的早期诊断方面具有巨大潜力。克拉热克拉热拉热[22]等收集结直肠癌确诊患者血清标本 40 例，癌前病变(包括溃疡性肠病、结直肠腺瘤) 患者血清标本 20 例，健康对照组血清标本 60 例，通过使用核磁共振技术，依托了最小二乘分析方法，对采样的三组血清进行了检测分析，观察了代谢物情况，最终得出结论：在结直肠肿瘤对象体内多种氨基酸含量出现了大幅度降低，但是血清内部的酮体含量却超出了正常范围。综合对比肿瘤患者与结直肠癌前病变患者的各项血清指标来看，肿瘤患者和结直肠癌前病变患者与正常人相比部分代谢物含量下降明显，如：血清胆碱、亮氨酸、β －葡萄糖代谢物等。结合实验数据推测出，结直肠癌前病变患者极有可能会癌变。马延磊[23]使用了GC—MS技术，引入了健康对象与患结直肠癌对象，通过实验数据发现二组对象的代谢谱与总代谢水平有显著不同，同时还参考了美闻标准以及技术研究院质谱数据库，对研究对象的代谢物进行了检测分析，应用数学模型PLS-DA进行模式特征性分类。同时对肠癌组与对照组的区分率利用监督性的聚类分析进行分析，结果发现与对照组代谢物相对含量相比，肠癌一组中血清L－缬氨酸、L－苏氨酸等含量显著较低，但是3-羟丁酸这一指标却增加，后来通过监督性分析方法进一步分析数据得出结论，为结直肠癌诊断提供了依据，将其诊断准确率大大提升至93.5%。Cheng等[24]使用气相色谱-飞行时间-质谱和超高效液相色谱四极杆串联飞行时间质谱分析，对101例CRC患者和103例健康受试者进行尿液代谢组学研究。研究发现在CRC受试者中观察到许多代谢途径失调，例如糖酵解，TCA循环，尿素循环，嘧啶代谢，色氨酸代谢，多胺代谢以及肠道微生物-宿主共代谢。并构建了含有七大代谢物的诊断模型。

2.2 评估疗效，指导个体化治疗

代谢组学在肿瘤的临床疗效检测和个体化治疗中也应用十分广泛。接受手术或放化疗的患者，体内肿瘤负荷显著降低，机体代谢也会相应发生改变。利用代谢组学技术分析患者代谢谱的变化有助于评估手术或放化疗的效果。Qiu 等[25]人综合对比了术前术后患者的代谢情况，并综合运用了正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)分析方法，得出二组数据存在显著差异，经过手术治疗后，实验组对象的氨基酸代谢水平提高，相对应的三羧酸循环和微生物代谢水平降低。患者与正常健康人员代谢组数据对比显示，经过手术干预治疗后，患者各项代谢水平正逐步恢复。Ma[26]综合使用了 GCMS 与模式识别技术，引入了30名研究对象，分析了手术干预前后的代谢水平变化，结果显示：经过手术治疗后，患者七大类代谢水平降低，如：L-缬氨酸、1-脱氧葡萄糖等等，但是L-酪氨酸代谢水平却增强了这为精准诊断和治疗提供了依据。

抗肿瘤药物基本治疗原理是抑制肿瘤生长，但是很难将肿瘤缩小。通过影像检查可以看出肿瘤变化情况，但是影像却不能全面揭示抗肿瘤药物的疗效，为此需要借助其他分析手段和技术，了解药物进入人体后的变化及过程，从而判断出药物的疗效[27]，以减少对病患的副作用，为临床用药提供指导，从而设计个性化的治疗方案。比如：国外学者Backshall[28]研究中引入了54名结直肠癌患者，这些患者都没有经过手术治疗，观察了患者化疗前后的代谢水平，得出了一系列实验数据，经过分析得出：化疗前患者的低密度脂蛋白衍生脂质越高，越容易产生化疗后的不良反应。

2.3 监测耐药情况

代谢组学在肿瘤的耐药性方面的研究是目前临床研究的一个热点课题。肿瘤耐药是目前临床上面临的一个棘手问题，也是导致患者化疗失败的重要原因。还有研究得出，一旦肿瘤细胞出现了耐药性，那么这些细胞就会在蛋白、半胱氨酸等通路上增加代谢能力，因此通过代谢组检测数据可以及时发现肿瘤细胞是否具有耐药性，从而为临床用药提供指导[29]。

3 代谢组学在CRC的中医辨证论治中的应用

结直肠肿瘤属中医“脏毒”、“锁肛痔”范畴。结肠是大肠的一部分，在中医理论中与脾肾密切相关。中医认为结直肠肿瘤的病理因素主要是湿、毒、瘀、虚。忧思抑郁，脾胃不和，湿热蕴结，日久化毒，乘虚下注，浸淫肠道，气滞血瘀，湿毒瘀滞凝结而成肿瘤；或饮食不节，久痢久泻，息肉虫积，损伤脾胃，运化失司，湿热内生，热毒蕴结，流注大肠，蕴毒积聚，结而为肿。总之，湿热下注、火毒内蕴，结而为肿是病之标；正气不足、脾肾两亏乃病之本。

大肠癌辨证关键在于首辨寒热虚实，次辨在气在血。大肠癌的病情复杂，临床表现形式多种多样，目前尚无统一的辨证分型。各位医家[30,31]在传承名家经验基础上结合自身临床体会，在对大肠癌的认识上具有一些相同点，如均认为病机为正虚邪实，虚实夹杂。中华中医药学会发布的《中华中医药学会标准-肿瘤中医诊疗指南》[32](08版)将大肠癌分为如下六种证型：脾虚气滞证、湿热蕴结证、瘀毒内阻证、脾肾阳虚证、肝肾阴虚证、气血两虚证。这是目前较有影响力的分类规范。

传统中医望闻问切的诊病方法因其主观性和缺乏统一的标准而被现代医学所质疑，辨证结果更是与医生的自身水平密切相关[33]。代谢组学方法可动态研究复杂条件下机体病理生理状态变化，揭示代谢相关疾病本质。这与中医“证”的概念十分契合。“证”是疾病发生和发展过程中某一阶段的病理概括。“证”不是一成不变的。代谢组学显示，随着时间的变化，代谢物的种类、浓度、比例也有变化。由此观之，代谢组学与中医症候存在很多相似之处，二者可以相互结合使用，将代谢组学用于中医症候研究中，有助于揭示中医证候的本质，为中医的现代化研究提供了新思路。

魏滨[34]等在对大肠癌和肝癌术后患者的血浆进行代谢组学分析后发现湿热证影响人体的糖代谢，并且以影响糖类物质分解和供能过程为主要特征(糖酵解和TCA是实现人体能量供给的重要通路)，包括氨基酸和嘌呤的转化和降解也受到湿热证的影响。马乃霞[35]通过HPLC-MS技术对晚期肠癌偏实证与偏虚证患者血清样品进行代谢组学分析，利用PCA、OPLS-DA分析法，得出结论：与偏虚证患者对比，偏实证患者血清中异亮氨酸、天冬氨酸、牛磺酸代谢水平较高，但是丙酮、乙酰乙酸以及阿洛酮糖代谢量较低。蒋鑫超[36]使用了超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱技术，对正常组与实验组对象的代谢情况展开了分析，实验中分别对正常人组和脾虚湿郁证大肠癌组患者的血浆和尿液进行检测分析，结合偏最小二乘法-显着性分析联合法寻找脾虚湿郁证大肠癌发生、发展密切相关的生物标志物群。经过研究得出大肠癌脾虚湿郁证的标志物簇，分别是：血清中的甘氨酸、L-丝氨酸、胆碱、精氨酸、柠檬酸五大类，尿液中的丙氨酸、柠檬酸、苯乙酰基谷氨酰胺三大类，同时实验中还发现了代谢物三羧酸循环情况，代谢物色氨酸的通路变化情况，从而为大肠癌疾病诊断或是脾虚湿郁证的证型鉴别提供了客观化和量化的一个标准。

4 讨论

代谢组学技术通过对代谢产物的分析，明确生物体的代谢水平，有利于探索生命调节中完整的代谢调控网络，对进一步了解疾病本质、药物的显效机制及潜在的生物标志物提供了新的思路[37]。但是目前代谢组学尚有许多不足之处[38-40]，如：①关于代谢组学检测数据较繁冗庞大，数据分析消耗时间成本较大，发展至今依然没有建设数据库，很难精准快速地找到对比标记物数据；②目前代谢组学研究样本量小，证候诊断无统一标准导致实验可重复性差，缺少验证性研究；③生物体代谢易受环境、心理等多种复杂因素影响，对实验结果都会产生一定的影响，结果会存在误差，加上各种分析技术的限制，至今还没有一项分析精准全面的方法，需要综合多种方法进行分析，且很多研究都是运用了动物做实验对象，构建的动物模型难以得到行业公认，且人与动物之间具有本质区别，动物实验指导临床缺乏说服力；④对于同个体的不同样本检测结果会存在差异，如：血液检测和尿液检测结果差异较大，结论就会产生分歧，给制定合理精准的治疗方案带来困难。将中医证型引入大肠癌模型中，研究其对大肠癌治疗和预后的影响并不多见。

现代医疗模式正逐渐从重视疾病向重视预防发展，《素问》有云：“圣人不治已病治未病”，这正是中医“未病先防”预防保健观念的体现。大肠癌的早发现、早治疗对于预后十分重要。虽然代谢组学技术并不完全成熟，但不可否认代谢组学技术在结直肠癌的预防和治疗方面有着其它组学无法取代的优势。代谢组学已经成为传统中医与现代医学交流融合的桥梁。如果能够将代谢组学与其他生物学科、技术融合，这对于中医领域的证候整体、动态、全面发展将会大有裨益，也将可以走出一条独具中国特色的中医治疗路径[41]。