m6A调节剂在肿瘤发生、发展中的分子机制研究进展

宋刚德，张蓓

(西安医学院第一附属医院，陕西 西安 710000)

1 简介

RNA是基因表达的核心元件，是遗传信息(DNA)和蛋白质之间的中介。到目前为止，已经发现了100多种RNA转录后修饰，包括mRNA、tRNA和非编码RNA[1]。在这些修饰中N6-甲基腺苷(m6A)RNA甲基化是mRNA中含量最丰富的修饰之一，其在多种生物学过程的发展中起着关键作用[2]。参与m6A甲基化的因子主要与三种蛋白有关。甲基转移酶是第一种类型，它们促进RNA中m6A的甲基化，这种编码基因被称为“编写者”；一些编写者包括METTL3、METTL5、METTL14、METTL1、RBM15、WTAP、Virma和ZCCHC4[2]。

METTL3和METTL14最初被认为是负责m6A修饰的甲基转移酶[3]，m6A的甲基化进而调节WTAP甲基转移酶的活性。但现在认为m6A的甲基化似乎与METTL3-METTL14复合物没有产生相应的作用，METTL3-METTL14复合物更多的起到了促进m6A甲基化基团加入RNA的作用[4]。m6A去甲基酶是第二种蛋白质，它们移除RNA的m6A甲基化基团，被称为“橡皮擦”，包括FTO和ALKBH5[5]。FTO是第一个发现的与人体体重和肥胖相关的基因，在所有成人和胎儿组织中广泛表达。据报道，FTO在白血病和胶质母细胞瘤中起癌基因作用[6]。ALKBH5作为第二个被鉴定的m6A去甲基酶，在人体免疫应答中起着关键作用。第三种是被称为“阅读器”的蛋白质，这些阅读器是与m6A甲基化位点结合的酶，在RNA稳定性中发挥特定的作用。阅读器包括YTHDCs、YTHDFs、IGF2BPs和eIF3[7]。含有YTH结构域的蛋白有5种，分别是YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3。其中，YTHDF2是第一个被发现的阅读器蛋白，并且对其在m6A修饰中的功能研究最多[8]。本文主要就m6A在肿瘤发生进展中的分子机制做一综述，并讨论了m6A其作为一种新的癌症生物诊断标志物和治疗靶点的前景。

2 m6A调节剂在肿瘤发生和肿瘤进展中的作用

2.1 m6A甲基转移酶的作用

m6A甲基转移酶复合物由METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429组成[9]。根据已发表的文章，这些甲基转移酶大多在癌细胞和组织中上调，在各种类型的癌症中通过调控不同的信号通路发挥癌基因的作用。例如，肝癌作为恶性肿瘤，其死亡率位居第三[10]。作为甲基转移酶复合体中的关键蛋白，METTL3在肝癌组织中表达上调，促进肝癌的发生和发展。机制上，METTL3通过m6A-YTHDF2介导的途径，抑制SOCS2(细胞因子信号2)的表达，在METTL3基因敲除的细胞中，SOCS2显著上调。另外，野生型METTL3基因敲除后SOCS2的表达增加，而突变型METTL3基因没有发生突变。据报道，SOCS2可以抑制多种癌症的细胞增殖、迁移和干细胞分化，如肝癌、白血病和口腔鳞癌[8]。

甲基转移酶METTL14能与METTL3形成稳定的异二聚体复合物，其中METTL3是催化活性亚基，而METTL14在m6A底物识别中起着关键的结构作用[11]。据报道，METTL3-METTL14复合物介导m6A参与调节mRNA的稳定性和翻译。大肠癌在男性癌症发病率中排名第三，在女性癌症中排名第二[12]。METTL3-METTL14复合体介导3’非翻译区中广泛周期素依赖激酶抑制剂p21的m6A修饰，导致p21表达增加。有趣的是，由METTL3-METTL14修饰的m6A增强了NSUN2介导的M5C甲基化，这两种甲基化方式协同促进了p21的表达，特别是在氧化应激诱导的细胞衰老中[13]。在HeLa细胞中，据报道，METTL14沉默比METTL3沉默能更显著地降低m6A水平[14]。

急性髓系白血病(AML)是一种骨髓造血细胞异常增殖的血液系统恶性肿瘤，其生物学特征是分化慢、增殖高、凋亡抑制[15]。Wilms的肿瘤1基因在白血病中具有致癌性，其过度表达与预后不良有关[16]。WTAP(Wilms肿瘤1相关蛋白)最初被鉴定为一种与人类Wilms肿瘤1蛋白结合的剪接因子[17]。进一步的研究表明，在依托泊苷治疗后，WTAP的下调显著增加了细胞的凋亡，而WTAP在AML中的过表达不仅促进了细胞的增殖，而且还诱导了延迟分化。

KIAA1429作为m6A甲基转移酶复合体的重要组成部分，是参与m6A修饰的重要甲基转移酶。在HCC中，KIAA1429在癌组织中表达上调，其高表达与HCC患者预后不良有关。从机制上讲，KIAA1429通过诱导下游靶基因GATA3的3’非编码区m6A甲基化，导致GATA3 Pre-mRNA降解，从而调控细胞增殖和转移。LncRNA GATA3-AS作为GATA3基因的反义链，促进KIAA1429对GATA3前mRNA的m6A修饰。这表明反义转录本衍生的lncRNA通过促进m6A修饰和靶Pre-mRNA的降解而下调靶基因的表达[18]。在另一项研究中，KIAA1429也被报道在肝癌组织中高表达，并通过m6A修饰和ID2mRNA的降解促进细胞增殖和迁移[19]。此外，据报道，KIAA1429通过以m6A非依赖性的方式调节细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)来促进乳腺癌的增殖和转移[20]。提示KIAA1429可能通过不同的途径调控癌细胞的增殖和迁移，包括m6A甲基化依赖或m6A甲基化非依赖性途径。

2.2 m6A去甲基化酶的作用

与正常组织相比，肿瘤组织中m6A甲基化水平通常升高。与m6A甲基化酶不同，m6A去甲基化酶被认为是m6A甲基化的负调节因子。目前越来越多的研究证据支持m6A去甲基酶在各种癌症中起致癌作用。FTO作为第一个被发现的RNA去甲基化酶，与人类脂肪和肥胖密切相关。据报道，FTO可以调节许多癌症的发展，FTO上调可预测预后不良，在肺鳞状细胞癌中起癌基因的作用[21]。FTO基因敲除可促进细胞凋亡，有效抑制细胞增殖和侵袭。机制上，FTO基因敲除显著抑制MZF1 mRNA水平，MZF1基因沉默显著抑制肺癌细胞活力和侵袭性。这些发现揭示了表观遗传学变化的关键机制，并为肺鳞状细胞癌患者提供了潜在的治疗靶点。

对于另一种脱甲基酶ALKBH5，缺乏会导致m6A修饰水平增加。ALKBH5及其去甲基化活性在mRNA输出和RNA代谢中起重要作用[22]。在胶质母细胞瘤干细胞样细胞(GSCs)中检测到ALKBH5的高水平表达，ALKBH5抑制主要通过影响FOXM1的去甲基化活性来降低GSCs的增殖和肿瘤发生。FOXM1在调节GSC增殖和凋亡中起关键作用，FOXM1在GSC中的过表达提示GBM患者存活率较低。在未来，ALKBH5-FOXM1可能成为GBM癌症患者的治疗靶点，并为临床治疗提供强有力的支持。

2.3 m6A结合蛋白的作用

m6A结合蛋白通过调节靶RNA的翻译、剪接、出核和衰变，在癌症发生和癌症进展中发挥关键作用。结合蛋白通常通过直接结合其特定的m6A位点来调节与癌症相关的靶RNA的表达。它们通常在各种癌症中表达增加，并能与甲基转移酶和去甲基酶相互作用。例如，YTHDC1与丝氨酸/精氨酸蛋白家族的成员关系密切，并在pre-mRNA剪接中发挥不同的作用[23]。YTHDC1通过与SRSF3相互作用，结合靶mRNA并通过出核途径转运RNA，从而将RNA募集到剪接和调节蛋白中。SRSF3的过表达导致PolyA RNA的核染色减少和胞浆染色增强，而敲除SRSF3目标基因可能导致相反的效果[24]。同时，相关研究表明，敲除YTHDC1会导致甲基化mRNA的核积聚，而结合YTHDC1则会促进转录本重新分布到细胞质[7]。宫颈癌是女性最常见的癌症类型之一，尤其是在像中国这样的发展中国家[25]，在敲除YTHDC1之后观察到的选择性剪接事件与METTL3基因敲除只显示出微弱的负相关性。这表明YTHDC1确实影响选择性剪接模式，但在宫颈癌细胞剪接位点的选择上可能发挥有限的作用[24]。也有报道称YTHDC1与前列腺癌有关[26]。同样，YTHDC1 mRNA的低表达水平与子宫内膜癌患者不良的临床预后直接相关[27]。

在大肠癌中，YTHDF1高表达，且与大肠癌患者预后不良有关。YTHDF1基因敲除导致抑制大肠癌细胞增殖和耐药。肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库分析表明，YTHDF1与癌基因转录因子c-Myc在大肠癌中的表达有关。YTHDF1基因的转录表达可以被c-Myc激活，而c-Myc基因的敲除显著抑制了YTHDF1基因在大肠癌细胞中的表达[28]。因此，m6A阅读器YTHDF1在大肠癌的进展中起着重要作用，并为药物治疗的未来发展指明了方向。

IGF2BPs还被报道以m6A依赖的方式增强Myc和其他目标转录本的表达[29]。最近的研究表明，IGF2BP1对肿瘤细胞中的IGF2BP家族具有致癌作用[30]。通过转录后调节mRNA的稳定性和翻译，IGF2BP1的敲除显著地抑制了细胞的增殖、侵袭，而IGF2BP1的过表达促进了宫颈细胞的增殖、迁移和侵袭[30]。

3 m6A调节剂在肿瘤发生和发展中的分子机制

3.1 m6A调节剂在细胞增殖中的作用机制

研究表明，m6A调节剂可通过多种信号转导途径调节肿瘤细胞增殖，如mTOR/AKT、miR222PTEN、AFF4/NF-κB/myc、Wnt/β-catenin、miR-375/YAP1等。例如，在子宫内膜癌中，通过突变METTL14或下调METTL3来降低m6A修饰mRNA水平，导致AKT表达上调来促进细胞增殖。具体而言，METTL14突变和METTL3下调通过两条途径促进AKT的活性。一方面，它们抑制YTHDF1介导的PHLPP2的m6A修饰，进而抑制PHLPP2的表达。另一方面，它们抑制了编码mTORC2亚单位的转录本(包括PRR5、PRR5L和mTOR)的m6A依赖性降解，并促进了AKT的活性[31]。除mRNA外，非编码miRNAs也可能是m6A调节剂的潜在靶点。METTL3是膀胱癌的癌基因，与膀胱癌患者预后不良有关。从机制上讲，METTL3通过与微处理器蛋白DgCr8相互作用，通过m6A依赖的途径正向调控pri-miR221/222的成熟，导致PTEN下调，从而促进肿瘤细胞增殖[32]。在另一项研究中，METTL3也在BCA中上调，并通过不同的途径促进肿瘤细胞的增殖。在机制上，METTL3以m6A甲基化依赖的方式增加增殖相关基因的表达，如NF-κB途径的两个关键调控因子AF4/FMR2家族成员4(AFF4)和MYC。此外，NF-κB和AFF4都可以通过直接与其启动子结合来促进MYC的表达，这表明MYC是一个新的多因素调控网络。在大肠癌中，METTL14表达下调，并与总生存率显著相关。METTL14基因敲除可通过miR-375/Yesated Protein 1(YAP1)途径降低大肠癌细胞m6A水平，促进细胞增殖。与Dgcr8在癌症中与原始RNA接合需要METTL14类似，METTL14也被发现通过与Dgcr8相互作用促进miR-375的成熟。MIR-375降低YAP1的表达，导致细胞增殖抑制[33]。

KIAA1429作为m6A甲基转移酶复合体中已知的最大组分，在肝癌组织中表达上调，与肝癌患者的预后呈负相关。KIAA1429通过GATA3 Pre-mRNA的m6A甲基化促进细胞增殖，导致HUR的分离和GATA3 Pre-mRNA的降解。值得注意的是，从GATA3的反义链转录而来的lncRNA GATA3-AS与KIAA1429一起抑制了GATA3的表达[18]。也有报道KIAA1429通过上调ID2mRNA的m6A修饰来抑制ID2蛋白的表达，从而促进肝癌细胞的增殖[34]。一般来说，大多数甲基转移酶在肿瘤组织中表达上调，并且与癌症患者的预后呈负相关。此外，大多数甲基转移酶，如METTL3和METTL14，抑制靶RNA的降解，而KIAA1429通过m6A甲基化促进相关RNA的降解。综上所述，这些研究表明，m6A调节剂可以通过不同的信号通路和靶向调节不同种类的RNA，包括mRNA、miRNA和lncRNA来调节癌细胞的增殖。

3.2 m6A调节剂在细胞迁移和侵袭中的作用机制

在癌症患者中，远处转移通常会导致较差的生存结局。因此，研究肿瘤转移的分子机制对于肿瘤的生物治疗至关重要。近年来，越来越多的证据表明m6A在细胞迁移中起重要作用。在肾癌中，ATP可能通过受体P2RX6增加癌细胞的迁移和侵袭。METTL14下调P2RX6蛋白的翻译，通过调节Ca2+介导的p-ERK1/2/MMP9信号通路增加肾癌细胞的迁移和侵袭[35]。在HCC中，METTL14通过增强DgCr8对primiR126的识别和对成熟miRNA的处理而与肿瘤转移密切相关，从而抑制HCC细胞的转移。在大肠癌中，METTL14还通过miR-375/SP1途径抑制细胞迁移和侵袭[33]。这些研究表明，METTL14在不同类型的肿瘤中不仅可以促进细胞的迁移和侵袭，而且可以通过多种信号通路抑制细胞的迁移和侵袭。

在肺癌脑转移过程中，METTL3介导的m6A修饰促进miR-143-3p的成熟。与原发性肺癌组织相比，MIR-143-3p在脑转移组织中表达上调。它通过抑制靶基因Vasohibin-1的表达，诱导肺癌的侵袭能力和血管生成。Vasohibin-1可以促进蛋白酶体介导的VEGFA的降解，并可以诱导微管蛋白解聚[36]。在胃癌中，METTL3在肿瘤组织中表达上调，其高表达与胃癌患者的预后呈负相关。在机制上，METTL3 m6A修饰其靶mRNA上的ZMYM1，并依赖于HUR增强其稳定性。ZMYM1通过招募CtBP/LSD1/corest复合物与E-cadherin的启动子结合并抑制其表达，从而促进EMT途径和转移[37]。METTL3还通过抑制p-p38和p-ERK抑制大肠癌细胞的迁移和侵袭，但其具体机制尚不清楚。这些研究表明，在不同类型的癌症中，METTL3可能在癌细胞迁移和侵袭过程中扮演相反的角色。m6A修饰及其调节剂的潜在生物功能有待进一步深入研究。除了在细胞增殖中的作用外，KIAA1429还可以通过m6A甲基化介导的GATA3 pre-mRNA的降解促进细胞转移，导致GATA3表达降低[18]。在HCC中，KIAA1429通过上调ID2mRNA的m6A修饰来抑制ID2，从而显著增强迁移和侵袭[34]。

3.3 m6A调节剂在细胞周期中的作用机制

细胞周期通过调节癌细胞分裂在肿瘤进展中起着重要作用。据报道，沉默METTL14或ALKBH5通过阻滞乳腺癌的G1-S期来抑制细胞周期。机制上，METTL14/ALKBH5激活HUR，这种反馈可以调节METTL14/ALKBH5以及细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E1的转录本的稳定性。ALKBH5和METTL14抑制YTHDF3的表达，YTHDF3反过来又阻断RNA去甲基酶的活性，并促进目标转录本的降解。因此，METTL14/ALKBH5与HUR构成正反馈环，调节细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E1的稳定性[38]。在肾癌中，METTL3mRNA和蛋白在肾癌组织中的表达均低于相应的癌旁组织。METTL3表达阴性与肿瘤体积较大、组织学分级较高、预后较差显著相关。METTL3通过上调p21蛋白的表达诱导G1期阻滞，p21蛋白在细胞周期调节中发挥重要作用[39]。P21通常被认为是G1/S转换过程中的负调控因子，它通过抑制CDK1/2-cyclin E/A的活性来实现，CDK1/2-cyclin E/A是从G1期进入S期所必需的[40]。据报道，在大肠癌中，METTL3和METTL14均通过METTL3/METTL14介导的m6A甲基化促进p21蛋白的表达[13]。葡萄膜黑色素瘤(UM)是最常见的眼内原发性肿瘤，其癌细胞和组织中m6A整体RNA甲基化水平和甲基转移酶METTL3的表达均显著增高。m6A甲基化阻断剂cycloleucine和METTL3的敲除都通过抑制细胞周期相关蛋白的表达，如p-CDC2，Cdk2，cyclin D2，cyclin D3，E2 F1和p-Rb，诱导细胞周期阻滞在G1期[40]。到目前为止，METTL3已被报道为肝癌、膀胱癌和UM等多种肿瘤中的癌基因，而在大肠癌和肾癌中起着抑癌基因的作用。这些在不同癌症中的不同作用可能归因于癌症的异质性。METTL3在调节肿瘤细胞多种生物学过程中的具体作用和机制还需要更多的实验来探讨。

水合黄芩苷(BH)是从中药中提取的天然化合物。在鼻咽癌中，BH显著诱导细胞周期阻滞于G2/M期。机制上，BH抑制FTO和ALKBH5的mRNA表达，促进METTL3和METTL14的mRNA水平。BH提高SUV39H1的m6A RNA甲基化水平，并促进其剪接[41]。

YTHDF2识别并降解MYC/CEBPA的甲基化mRNA，并显著降低其表达。MYC信号通路通过CDK4和CDK6等关键靶点调节G0/G1细胞周期转变[42]。在另一项研究中，YTHDF1在HCC组织中上调，根据对TCGA数据库的分析，高表达与低表达相比显著缩短了5年生存率。还通过对YTHDF1共表达基因的GO和KEGG通路分析，在调节肝癌细胞周期中发挥重要作用。同样，另一项研究显示，METTL3和YTHDF1在癌组织中均上调，并作为HCC患者的独立预后不良因素。据报道，它们参与调节HCC的细胞周期[43]。上述研究表明，大多数m6A调节剂通过靶向调控不同的基因参与细胞周期的调控。它们大多通过细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E1、p21、CDK1、CDK2、CDK4和CDK6等关键靶点调控G1/S期细胞周期转换。一些抗癌药物，如BH和R-2HG，也通过直接调节关键的m6A调节剂的表达参与细胞周期的调节。

3.4 m6A调节剂在细胞凋亡中的作用机制

细胞凋亡通过信号转导途径在肿瘤的发生、发展中起着非常重要的作用，主要有内源性途径和外源性途径。近年来，越来越多的证据表明，m6A调节剂通过内源性线粒体途径、内源性ER途径和外源性途径诱导癌细胞凋亡。例如，METTL3在乳腺癌中上调。METTL3的敲除通过下调Bcl-2的m6A修饰水平及其表达而加速细胞凋亡[44]。同样，METTL3沉默也通过减少胃癌细胞中的Bcl-2，增加Bax和激活caspase-3来激活凋亡途径[45]。Bcl-2、Bax和活化的caspase-3被认为是通过内在线粒体途径影响细胞凋亡的关键调控因子。此外，METTL3通过诱导m6A甲基化，促进IGF2结合蛋白1(IGF2BP1)对SEC62mRNA的稳定作用，上调癌基因SEC62，使SEC62蛋白表达增加，从而抑制细胞凋亡。此外，miR-4429可以通过抑制METTL3/SEC62途径促进胃癌细胞凋亡[46]。SEC62是调节哺乳动物内质网(ER)膜蛋白输入的转位复合体的一个组成部分[47]。它是维持和恢复内质网稳态的重要调节因子，其失衡是通过内源性内质网途径诱导细胞凋亡的潜在途径。在鼻咽癌中，锌指蛋白750被METTL3介导的m6A修饰下调，通过上调FGF14诱导凋亡来抑制细胞生长[48]。FGF14被认为是电压门控钠通道和KCNQ2/3通道的调节者，在膜电位的调节中可以组织通道定位，协调KCNQ和VGSC的电导[49]，其失衡可以诱导细胞凋亡。

据研究报道，前列腺癌细胞中METTL3的表达和m6A甲基化水平均升高。METTL3基因敲除通过减少m6A甲基化和GLI1表达促进细胞凋亡。Gli1作为Hedgehog途径的重要组成部分，在细胞凋亡调控中发挥着重要作用[50]。此外，FTO作为一种关键的去甲基化酶，在乳腺癌中起癌基因的作用。FTO通过在BNIP3 mRNA的3’非编码区去甲基化，诱导其降解，从而下调促凋亡基因BNIP3的表达。这一过程是通过YTHDF2非依赖的机制介导的，并导致细胞凋亡的抑制[51]。这项研究表明，FTO可能是细胞凋亡的负性调节因子，其作用机制可能是通过增加癌基因表达或降低抑癌基因表达来实现m6A。YTHDF2在AML中过表达，降低了参与LSC功能整体完整性的各种m6A转录本的半衰期，包括肿瘤坏死因子受体Tnfrsf2，它的上调促进细胞凋亡。综上所述，大多数m6A调节剂通过调控靶基因如Bcl-2、Bax、活性caspase-3、SEC62、FGF14、GLI1和Tnfrsf2的表达参与癌细胞凋亡，而这些基因是信号通路的重要组成部分。

4 m6A调节剂作为癌症患者的诊断生物标志物或治疗靶点

m6A调节剂，包括m6A甲基转移酶、去甲基化酶和m6A结合蛋白，在癌细胞增殖、迁移和侵袭、细胞周期和细胞凋亡等过程中发挥重要作用。最近的实验，如组织芯片、IHC染色和生存分析，已经被用来评估m6A调节剂在癌症中的潜在临床功能。越来越多的文章报道，m6A调节剂与各种癌症患者的临床特征密切相关，可用作癌症的诊断生物标志物或潜在的治疗靶点。大多数m6A调节剂，包括METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDF2和IGF2BP1在癌症患者中上调，并作为预后不良的诊断标志物。值得注意的是，METTL3和METTL14表达下调，预测乳腺癌患者预后良好[52]。METTL3在胃癌患者中也表达下调，可以作为一个很好的诊断生物标记物[53]。METTL14也被下调，是HCC患者无复发生存的良好预后因素，与肿瘤转移显著相关。在肝内胆管癌患者中，m6A去甲基化酶FTO的表达降低，预示着良好的预后[54]。同一个m6A调节剂预测不同癌症不同预后的事实可能由于不同癌症的多样性。需要进一步的研究来探索m6A调节剂作为癌症患者治疗靶点的作用。

5 结论及展望

综上所述，我们总结了m6A调节剂在肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭、细胞周期和凋亡中的作用及其相应的分子机制，特别是m6A的上下游靶基因之间的关系。根据以往的研究，m6A调节剂可以通过影响一些众所周知的靶基因，如akt、mTORC2、myc、β-catenin和yap1来调节细胞的增殖。同时，m6A调节剂还可以调节非编码RNA的表达，反之亦然。通过进一步深入研究m6A调节剂的生物学功能，无疑将扩大我们对m6A修饰及其在肿瘤发生发展中的分子机制的理解。基于这些发现，一些m6A调节剂及其关键靶点可能为癌症早期诊断提供新的可能性。此外，对其他已确定的m6A结合物的研究可能有助于解决这些问题，并为未来药物治疗的发展提供新的方案。