PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂抗肿瘤疗效预测中肿瘤相关生物标记物和HPD预测因子的应用

李阳，默峰，王涛，周晔，邓新娜，李庆霞

1 河北省人民医院肿瘤科，石家庄 050051；2 河北省人民医院神经外科；3 河北医科大学第一医院肾内科

程序性死亡受体1（programmed death 1，PD-1）是CD28 超家族中重要的免疫抑制分子，由人PDCD1 基因编码，在肿瘤坏死因子的刺激下其表达增强。PD-1 的主要配体为程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）、PD-L2。近年来，以PD-1/PD-L1 抑制剂为代表的免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）是肿瘤治疗领域的研究热点。目前，PD-1/PD-L1 抑制剂已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于一二线抗肿瘤治疗中。黑色素瘤［1］、头颈部癌［2］、乳腺癌［3］、非小细胞肺癌［4］等多种肿瘤组织及肿瘤浸润型淋巴细胞中均可检测到PD-L1表达。ICIs的治疗原理为阻断PD-1与PD-L1 的结合，使T 细胞恢复杀伤肿瘤细胞的活性［5］。目前接受PD-1/PD-L1 抑制剂单药治疗的肿瘤患者总体客观缓解率（objective response rate，ORR）仅为10%～40%，甚至部分患者在PD-1/PDL1 抑制剂治疗后出现疾病的超进展（hyperprogressive disease，HPD）［6-7］。

因此在PD-1/PD-L1抑制剂治疗之前，对疗效预测相关的生物标志物进行检测，筛选潜在的治疗获益人群，避免无效治疗及经济损失十分重要。某些生物标志物表达水平越高，患者临床获益越多。临床研究中通常把与疗效正相关的这类生物标记物称为正向生物标记物［16］。有的生物标志物高表达可导致PD-1/PD-L1抑制剂治疗疗效差或肿瘤耐药时，将该生物标记物称之为PD-1/PD-L1 抑制剂治疗相关的负向生物标记物。此外还有部分生物标志物提示PD-1/PD-L1 抑制剂治疗中出现疾病超进展（HPD）的肯能性大，称为免疫疗效超进展预测因子，如EGFR、ALK、MDM2/MDM4 等。根据疗效生物标志物对PD-1/PD-L1抑制剂疗效不同的预测作用，分类进行综述如下。

1 正向生物标志物在PD-1/PD-L1 抑制剂治疗效果预测中的应用

最新研究认为，PD-L1、微卫星高不稳定性（microsatellite instabil-ity-high，MSI-H）/错配修复缺陷（deficient mismatchrepair，dMMR）、肿瘤突变负荷（Tumor Mutational Burden，TMB）、瘤浸润淋巴细胞（TILs）等可能是PD-1/PD-L1 抑制剂疗效相关的正向生物标志物。

1.1 PD-L1 PD-L1是目前临床应用最广泛的预测肿瘤免疫治疗效果的标记物之一。FREEMANKELLER 等［8］研究发现，高表达的PD-L1是恶性黑色素瘤患者治疗后总生存率低的独立危险因素。FUCHS 等［9］在KEYNOTE-059 研究中发现，相较PDL1 表达阴性的肿瘤患者，接受派姆单抗治疗的二线晚期胃癌及胃食管连接处癌患者中，肿瘤或间质细胞中PD-L1阳性的患者治疗效果更好。表皮生长因子受体（EGFR）或渐变性淋巴瘤激酶（ALK）阴性的晚期或转移性非小细胞肺癌患者中，PD-L1 表达≥1%且EGFR 或ALK 突变阴性的晚期/转移性非小细胞肺癌患者接受单药派姆单抗治疗总生存期显著长于化疗组［10］。MITTENDORF 等［11］研究发现，与非三阴性乳腺癌组织比较，三阴乳腺癌组织标本中PDL1 mRNA 的相对表达量高，后续进一步研究提示，PD-L1 三阴性乳腺癌独立的预后预测因子。既往研究中，多采用免疫组织化学（immunohistochemis-try，IHC）法检测肿瘤组织PD-L1，部分研究者认为，IHC检测结果为PD-L1 表达阴性，也并不意味着患者对PD-1/PD-L1抑制剂的治疗无效。

PD-L1 阴性表达的肿瘤患者也可通过免疫相关药物治疗获益。VOKES 等［12］比较了Nivolumab、多西他赛治疗晚期鳞状细胞肺癌和非鳞非小细胞肺癌的临床效果后发现，即使肿瘤组织中PD-L1 阳性表达率低于1%，与多西他赛编校，nivolumab 治疗的患者中位OS 更长。猜测其可能原因为，PD-L1 的表达在不同肿瘤类型、不同部位中存在异质性，而治疗方式及疾病进展不同，可能也会影响PD-L1 的表达。不同的检测抗体、设定的阳性阈值以及检测平台的差异也会影响检测结果。PD-L1 不仅在肿瘤细胞中表达，在免疫细胞中也表达，而多数IHC检测忽略了免疫细胞表达，且在免疫治疗的过程中PD-L1 的表达也会发生变化。但现有的研究普遍显示，PD-L1阳性率较高的患者应用PD-1/PD-L1 抑制剂治疗效果较好，获益时间更长，因此PD-L1是目前临床上常用PD-1/PD-L1抑制剂疗效的正向生物标志物。

1.2 MSI-H/dMMR MMR 的主要功能是纠正DNA复制中出现的错误，确保复制过程的保真性，但启动子的超甲基化、移码突变等，使错配修复蛋白表达缺失导致MSI-H/dMMR。存在MSI-H/dMMR 的患者可能从PD-1/PD-L1抑制剂中获益，约15%的结直肠癌患者基因检测结果为MSI-H 型［13］。ASAOKA 等［14］首次报道，对存在MMR 的肿瘤患者采用Pembrolizumab 治疗，25 例患者有16 例（57%）出现治疗相关反应，另9 例患者（32%）病情稳定（SD）。2017 年Pembrolizumab 成为在美国获批的首个抗PD-1 药物，提示MMR 状态可预测Pembrolizumab 的临床疗效。HAUSE 等［15］通过基因组测序分析了多个肿瘤的5 930 个基因组后发现，其中14 种恶性肿瘤组织存在MSI-H，结直肠癌、胃癌及子宫内膜癌组织中MSI-H 频率显著高于其他肿瘤，但占恶性肿瘤患者的比例仍然较小。目前临床上普遍认可胃、结直肠恶性肿瘤患者，肿瘤组织中MSI-H/dMMR 的患者应用PD-1/PD-L1抑制剂疗效更好，获益率更高。

1.3 TMB TMB 为肿瘤基因组中平均1Mb（100 万个碱基）范围内所含体细胞突变的数量。TMB 越高，说明人体内可以被免疫细胞识别的突变新抗原越多，免疫反应越容易被激活。TMB 高的肺癌、肠癌和黑色素瘤患者对PD-1/PD-L1 抑制剂治疗的响应率更好或临床收益更高。RIZVI等［16］研究显示，高突变负荷非小细胞肺癌患者更容易从PD-1/PD-L1抑制剂治疗中获益。YARCHOAN 等［17-18］研究发现，肺癌、直肠癌及肝癌等多种恶性肿瘤的患者均接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗，治疗前患者TMB与ORR呈显著正相关。HELLMANN 等［19］采用Nivolumab 联合Ipilimumab 治疗了晚期或复发性非小细胞肺癌患者，结果发现，高TMB的肿瘤患者较低TMB患者的中位PFS更长。一项Ⅲ期KEYNOTE-158研究分析了Keytruda（pembrolizumab）治疗进展期实体瘤患者疗效与TMB 的关系，结果发现Keytruda 单药对于非tTMB-H（＜10 mut/Mb）患者，客观缓解率（ORR）仅为6.7%，而tTMB-H患者的ORR可以达到30.3%。

1.4 TILs 肿瘤组织中PD-1/PD-L1 的表达分为诱导表达和固有表达两种［20］。TILs 分泌的IFN-γ 等细胞因子能诱导肿瘤细胞PD-1/PD-L1表达，提示肿瘤中PD-1/PD-L1表达与TILs存在有关。TUMEH等［21］建立了CD8+TILs 表达与PD-1/PD-L1 免疫抑制剂疗效的预测模型，检测患者肿瘤侵袭边缘及肿瘤内部CD8+TILs 表达与PD-1/PD-L1 免疫抑制剂治疗疗效的相关性，结果发现与治疗无效患者比较，PD-1/PD-L1 免疫抑制剂治疗有效的患者肿瘤边缘及内部CD8+T 细胞数量明显增高，且肿瘤内部的CD8+T 细胞与肿瘤退缩程度呈正相关。URYAEV 等［22］研究发现，在恶性黑色素瘤及非小细胞肺癌中CD4+和CD8+TILs 丰度与PD-1/PD-L1 抑制剂治疗后的反应率均呈正相关。但当CD8+TILs计数≥1 900/mm2时在非小细胞肺癌患者中PD-1/PD-L1 抑制剂治疗疗效远不及恶性黑色素瘤，提示在不同肿瘤中TILs的PD-1/PD-L1免疫抑制剂疗效预测作用可能存在差异。

1.5 其他 随着肿瘤免疫治疗的迅猛发展，对于分子标记物的探索越来越多。POLE、POLD1、KRAS、TP53、CDK12、ARID1A 和ARID1B 等基因均可能是PD-1/PD-L1免疫抑制剂疗的正向预测生物标志物。

POLE和POLD1基因均参与DNA的复制及损伤修复，如若发生突变可能会引起修复功能的缺失，导致损伤DNA 积累，进而使肿瘤突变负荷增加，因此POLE 和POLD1基因突变的患者可能从PD-1/PD-L1抑制剂治疗中获益。KRAS或TP53基因突变可能会导致PD-L1的表达增加，CD8+T细胞浸润增加及肿瘤免疫原性增强。CHEN等［23］研究发现，KRAS突变可以通过p-ERK 信号诱导肺腺癌中PD-L1 的表达。KRAS 或TP53基因突变也可能是正性预测生物标志物。

CDK12 基因的双拷贝缺失基因型的肿瘤中可能含有更多的免疫细胞，其细胞表面新生抗原也相对多，更易被免疫系统识别并清除，因此能更好地对PD-1/PD-L1抑制剂治疗作出反应。

7%的非小细胞肺癌患者携带ARID1A 突变，4%患者携带ARID1B 突变。进一步研究发现，存在ARID1A、ARID1B 突变的非小细胞肺癌患者对PD-1/PD-L1 抑制剂治疗的反应更好，提示ARID1A 和ARID1B 突变有可能作为晚期非小细胞患者对免疫抑制剂敏感性的新型生物标志物［24］。

2 负向生物标志物在PD-1/PD-L1 抑制剂抗肿瘤治疗效果预测中的应用

调节性T 细胞（Regulatory T cells，Tregs）、β2-微球蛋白（B2M）及JAK1 基因可能是PD-1/PD-L1 抑制剂抗肿瘤治疗效果预测的负性标志物。它们的高表达提示患者应用PD-1/PD-L1 抑制剂抗肿瘤治疗效果较差。筛选PD-1/PD-L1 抑制剂治疗相关的负向生物标志物，有助于临床医师在PD-1/PD-L1抑制剂治疗前筛选不获益人群，保证患者的有效治疗时间，提高患者预后。

Tregs 是调控免疫反应性的一类T 细胞亚群，可通过抑制肿瘤微环境参与肿瘤的免疫逃逸，降低免疫治疗的效果，可作为PD-1/PD-L1抑制剂抗肿瘤治疗的负向标志物。Tregs 细胞可通过分泌IL-10、TGF-β 等负性免疫调节因子，发挥免疫抑制作用。高表达的IL-10 可抑制肿瘤细胞中APC 的浸润、分化、成熟以及对抗原的趋化反应，使细胞毒性T淋巴细胞（CTL）处在免疫无能状态［25］。Treg 细胞同时可促进TGF-β 的分泌，抑制NK 细胞及CTL 的活性、抑制Teff 细胞分化为Th1 和Th17 细胞，促进T 细胞的耗竭［26］。研究发现，接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗的黑色素瘤、肝癌、肾细胞癌患者中，Tregs细胞水平与患者预后均呈负相关，即Tregs 细胞水平越高，患者应用PD-1/PD-L1抑制剂治疗效果越差［27-29］。

B2M、JAK1、PTEN 基因可能也是PD-1/PD-L1抑制剂抗肿瘤治疗效果预测的负性标记物。B2M蛋白与HLA 形成及运输至细胞表面相关，该基因发生缺陷导致CD8+T 细胞的识别降低，可能导致患者出现PD-1/PD-L1抑制剂耐药。

JAK1或JAK2的继发突变可能通过介导肿瘤细胞对干扰素敏感性降低，导致患者对免疫治疗的出现耐药。PTEN 蛋白的缺失可能引起T 细胞肿瘤浸润降低、T 细胞扩展受到影响，影响PD-1/PD-L1 抑制剂的治疗效果。

3 HPD 的预测因子在PD-1/PD-L1 抑制剂抗肿瘤治疗效果预测中的应用

在临床工作中，部分患者在应用PD-1/PD-L1抑制剂治疗后效果较差或耐药，9%左右的肿瘤患者在接受免疫治疗后出现HPD。目前免疫治疗后患者出现HPD 的具体作用机制尚不明确。但临床工作中发现部分基因突变可能导致患者应用PD-1/PDL1 抑制剂后出现HPD，其中EGFR、ALK、MDM2/MDM4等基因的作用机制相关研究较深入。

3.1 EGFR 突变或ALK 重排 EGFR 突变或ALK重排可能影响PD-1/PD-L1抑制剂的疗效，约20%的存在EGFR 突变或ALK 重排的肿瘤患者发生HPD。RAMALINGAM 等［30］对PD-L1≥50%的非小细胞肺癌患者采用pembrolizumab 治疗，亚组分析结果显示，存在EGFR 突变的非小细胞癌患者中位OS 显著低于EGFR 野生型患者，EGFR 突变阳性的患者肿瘤组织中PD-L1表达水平及CD8+TILs浸润数量均少于野生型患者。LIU 等［31］研究发现，存在EGFR 或ALK基因突变的肿瘤患者PD-L1+/CD8+相对较低。Nivolumab 治疗后的EGFR 或ALK 突变的肿瘤患者PFS及5年生存率低，甚至部分患者出现HPD。

3.2 MDM2/MDM4扩增 KATO等［32］研究发现，155例接受免疫检查点抑制剂治疗的肿瘤患者中，6例患者治疗失败时间TTF＜2个月，其中携带MDM2/MDM4扩增的患者中67%（4/6）发生HPD。可能作用机制为免疫抑制剂可促进干扰素调节因子-8 的表达，通过JAK-STAT信号传导与MDM2启动子结合，进一步导致MDM2 扩增过表达。MDM2/4 的扩增可能是PD-1/PD-L1抑制剂治疗后出现HPD的预测因子。

此外，DNMT3A 失活突变、BRCA2 突变也可能是PD-1/PD-L1 抑制剂治疗后出现疾病超进展（HPD）的预测因子。

综上所述，PD-L1、MSI-H/dMMR、TMB 等PD-1/PD-L1抑制剂疗效相关的正向预测因子，Tregs、B2M等PD-1/PD-L1 抑制剂疗效相关的负向预测因子，EGFR、ALK、MDM2/MDM4 等PD-1/PD-L1 抑制剂治疗后HPD 的预测因子，均可作为PD-1/PD-L1 抑制剂疗效预测的生物标记物。但上述的疗效预测生物标记物往往并非单独发挥作用，不同生物标记物在肿瘤标本或血液标本中相互作用。有研究［33］证实，PD-L1 对免疫性T 细胞的强化效应和TMB 共同决定PD-1/PD-L1 抑制剂的疗效。多个预测生物标记物的联合应用才能更好地筛选出免疫检查点抑制剂治疗的优势人群，使患者临床获益最大化。VILAIN等［34］分析了接受抗PD-1 抑制剂治疗的黑色素瘤患者治疗前、治疗2 个月内以及进展后PD-L1 的表达丰度和相关免疫细胞的变化。研究发现随着治疗的进行，PD-1 的表达丰度在不断变化，因此，有些生物标记物只有实时监测才能真正实现疗效预测。最新研究［35］发现，肿瘤微环境中特定淋巴样细胞的存在和相对平衡，包括T 细胞活化、记忆和调节和NK 细胞亚群，可更好反应免疫抑制剂的治疗敏感性。对外周血中这些细胞亚群的分析作为更易获得和均质的样本可能有助于有关免疫检查点抑制剂疗效快速预测的临床决策。今后应进一步进行联合生物标志物检测，建立多维度综合预测模型，探索其在PD-1/PD-L1 抑制剂治疗效果预测中的作用，以期找到更加高效、精确的生物标志物。