中药对耐药菌生物膜抑制作用的研究进展

解寻 孔晋亮 罗劲 卢桦崧 刘冬梅

广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科（南宁 530021）

生物膜（BF）是细菌生长的一种自然形式，在自然环境中无所不在。它是附着于组织表面，并嵌在细胞外基质（ECM）中的菌群。BF是在几十亿年的生存压力下形成，是耐药菌能够适应几乎所有的生存环境的一种生存方式［1-2］。与浮游菌相比，由于BF的屏障等作用，病原菌对抗生素的耐药性要明显高出10～1 000倍［3］。同时，在BF的保护下，病原体逃避宿主免疫攻击，从而使病原体难以被清除，形成慢性感染灶［2］。目前在临床上对抗感染的主要办法抗生素等抗菌药物存在着一定的副作用，并且病原菌能够产生BF从而对此类药物更加容易产生耐药性［3-4］。而中草药等天然植物的提取物在防治感染性疾病中有着独特的优势，有着药效持续时间长，成本低易获取，较少出现毒副作用，不易产生耐药，作用位点丰富等特点［5］。因此，中草药提取物在抑制细菌BF感染方面将会有广阔的应用前景。近年来大量研究表明，中药提取物能够在体外对BF有良好的抑制作用。但体外模型中的情况与在人体内的情况有很大不同，并不能模拟宿主环境的复杂性，需要进行更多动物模型方面的研究［6］。本文试将耐药菌BF耐药机制及近年来不同中药提取物对各种细菌体内BF形成干预研究的进展情况进行综述，以期为挖掘新的抗菌药物以及中药提取物应用于临床提供指导性意见。

1 BF耐药机制研究

1.1 屏障作用 有研究表明，相对于浮游状态，由于BF的包裹，感染暂时局限化，但是其屏障作用能够保护BF菌免受药物以及机体免疫的清除［3］。DJERIBI等［7］的研究表明，BF通过其致密的结构，以及分子间相互作用力阻止抗菌药物进入BF内，从而提高BF菌的耐药性。

1.2 外排泵 外排泵作为一种转运蛋白，能够将多种化合物排出BF外，其中包括代谢产物与抗菌药物。由于BF中的氧气和营养物质受限促使外排泵基因表达增强，使细菌对抗菌药物的耐药性增强［8］。同时，外排泵还能够将群体感应（QS）信号分子排出，通过调节QS信号通路，影响BF形成［9］。

1.3 QS信号通路 QS信号通路是单个细菌之间为了应对外部环境，通过信号交流调控并最终调节群体行为依托的信号通路，它对于整个BF的适应和生存是至关重要的。细菌可通过QS系统调控自身基因，刺激产生大量胞外多糖，使BF的结构更加致密，强度增强，对外来威胁的抵抗能力更强。此外，QS系统还能响应细菌密度与环境压力的变化，使BF对药物的抗性增强［10-11］。

1.4 环鸟二苷（c-di-GMP）信号通路 c-di-GMP是一种普遍存在于细菌中的第二信使分子，高水平的c-di-GMP会降低鞭毛活性，增加黏附素和胞外多糖的表达［12］。此外，c-di-GMP水平还影响到细菌生长代谢速率、膜通透性等BF形成相关因素［13］。c-di-GMP信号通路还能够通过调节QS信号通路对BF形成进行调控［14］。

2 中药抗耐药菌BF的体内研究

2.1 甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA） 金黄色葡萄球菌是院内感染中培养出的最常见的革兰氏阳性菌之一，随着生物植入材料的广泛应用，金葡菌也是临床因BF导致的医疗导管相关感染引起的败血症中最常见的致病菌之一［15］。黄芩是一味我国常见中草药，有清热燥湿、泻火解毒的功效。黄芩的主要作用成分黄芩苷对QS系统有抑制作用，并且能够减少金葡菌BF的形成［16］。杜仲业在过去的实验中证明黄芩苷能够在体外破坏金黄色葡萄球菌BF，并在与利奈唑胺联合使用时能够起到协同作用，使利奈唑胺能够更加轻易进入细菌的BF内，然后杀灭膜内活菌。为进一步研究黄芩苷联合利奈唑胺在体内抗生物膜效果，杜尝试构建了大鼠体内的金葡菌BF感染模型。结果表明，黄芩苷对金葡菌在大鼠体内形成的BF有破坏作用，但是对膜内的细菌没有杀灭作用或杀灭作用较低［17］。

香叶醇是一种无环单萜醇，天然存在于柠檬、柠檬草、薰衣草的精油中。在Kannappan的研究中，秀丽隐杆线虫被用来作为金葡菌载体。该研究证实，与单药组或未加处理的对照组相比，香叶醇和头孢噻肟联合使用能够更有效的抑制病原体形成 BF［18］。

Peng的研究表明，在金黄色葡萄球菌假体周围关节感染模型中，姜黄素纳米颗粒（CURN）能够抑制金葡菌BF诱导的骨髓间充质干细胞（MDSCs）的扩增并提高M2表型细胞的表达水平，以逆转BF诱导的T细胞下降，从而联合万古霉素使金葡菌BF相关感染引起的渗透性破坏有效地恢复［19］。

2.2 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA） 吴宝林在对复春散1号对MRSA感染创面的疗效研究中发现，单独使用复春散1号能够对创面MRSA生物被膜结构进行破坏，而联合利福平可以更好地清除MRSA生物被膜［20］。而在另一项关于金黄色葡萄球菌BF慢性创面感染的研究中，黄芩联合莫匹罗星被证实能够通过破坏创面BF，减少创面痂下组织菌量，加快创面愈合，提高疗效［21］。

WANG的研究表明［22］，黄芩苷能够抑制MRSA的生长，减少BF形成，从而减少感染相关的组织损伤，提高MRSA感染小鼠的总存活率。而另一项关于花旗松素的研究证明，花旗松素通过干扰黏附阶段抑制BF形成，从而提高MASR小鼠存活率。而该药对成熟BF并无破坏作用［23］。

2.3 表皮葡萄球菌 表皮葡萄球菌是一种通常存活于正常人皮肤表面的菌群，一般情况下并不致病，但可介入治疗等特殊情况下可伴随分子材料进入人体，在入侵血液循环后还可导致败血症，产生严重后果［24］。KANNAPPAN等［18］对表皮葡萄球菌也做了相同的体内研究，在香叶醇和头孢噻肟不同组合的处理下，得到了与金黄色葡萄球菌相同的结果。

2.4 铜绿假单胞菌（PA） 铜绿假单胞菌是一种需氧型革兰阴性菌，属于机会致病菌，是住院患者等免疫力低下人群易感的病原菌之一［25］。蒜素是大蒜的主要有效成分之一，对多种病原微生物有不同程度的杀灭和抑制作用。在这方面，BJARNSHOLT等［26］在小鼠肺部感染模型中发现大蒜提取物使铜绿假单胞菌对妥布霉素、呼吸爆发，以及中性粒细胞吞噬反应敏感性增加。HARJAI等［27］在小鼠尿路感染模型中，大蒜提取物还能够减少毒力因子的加工，和减少铜绿假单胞菌的QS信号。

为了探讨黄芩苷与美罗培南（MEM）单药和联合使用对铜绿假单胞菌BF体内感染的作用。岑艳灵等构建了铜绿假单胞菌小鼠腹腔感染形成早期BF的感染模型。该研究表明，单独使用黄芩苷能够一定程度上破坏铜绿假单胞菌体内感染早期形成的BF，而与MEM联合用药能够显著增强其对BF感染的杀菌作用［28］。另外，同一课题组的LUO的研究中［29］，证实了黄芩苷能够抑制铜绿假单胞菌的QS基因，导致QS信号分子减少，从而降低毒力因子的产生以及生物被膜的形成。这一结果在体内外实验中同时得到了证实。

绿原酸也能通过调节铜绿假单胞菌的QS系统，减弱PA在体内的毒力以及BF的形成，导致秀丽隐杆线虫和小鼠感染模型的致病性降低［30］。

2.5 白色念珠菌 白色念珠菌是一种机会致病菌，是侵袭性念珠菌病最常见的病原体，其产生的BF是白色念珠菌产生耐药性的重要原因［31-32］。炎琥宁（YHN）是天然植物穿心莲的主要作用成分穿心莲内酯的一种衍生物，具有祛热解毒，消炎止痛的功效。施高翔等人为探究YHN在大鼠体内对白念珠菌BF的作用，建立了白念珠菌大鼠皮下导管模型。结果表明，炎琥宁能在白念珠菌BF的形成过程中起到有效的抑制作用，并存在浓度依赖性。同时YHN且能够明显的降低白色念珠菌在黏附于导管上的能力，这极可能是降低大鼠体内白色念珠菌BF的形成的原因之一［33］。

2.6 致龋菌 曹茜茜在探究人参皂苷Rh2对致龋菌BF的作用时进行了体内外研究。通过结晶紫染色法和激光共聚焦扫描显微镜观察体外BF的改变，并建立大鼠龋齿模型，通过颌骨显微断层扫描以及Keyes龋齿计分评价人参皂苷Rh2的抗龋作用。结果表明，Rh2能够在体外模型中抑制致龋菌的BF形成，并且在体内也有一定的抗龋保护能力［34］。

2.7 混合感染 王瑶等在他们的研究中建立烧伤后混合感染铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的小鼠模型，用于探究烧伤创面感染的防治方法。该研究用穿心莲内酯和庆大霉素对小鼠烧伤创面进行干预处理。其结果表明，穿心莲内酯与庆大霉素具有协同作用，穿心莲内酯能够促进庆大霉素破坏BF，减少炎症因子及毒力因子［35］。另外，SHAN等［36］在研究金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物膜相关慢性难治性伤口大鼠模型中，发现清热败毒合剂与五味消毒饮均能下调AI-2从而抑制BF的形成，并且能够上调HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α以及VEGF，同时聚集巨噬细胞，促进肉芽生长，提高伤口愈合速度。

3 总结与展望

目前，如何治疗BF耐药菌相关感染是对临床上抗菌治疗的极大挑战，破坏和抑制BF形成也是我们在耐药菌治疗中的研究重点。如本文所述，中草药资源为筛选抗BF制剂提供了巨大的资源。中药提取物通过调节QS系统、降低黏附能力、提高免疫细胞反应、与抗生素协同等多种途径起到抗BF作用，有着广泛的药理作用和临床实用价值。尽管中药抗BF作用研究已取得了一定的进展，但相比大量的体外研究，体内试验相关研究明显较少，而中药能够在动物模型中起到良好的抗BF作用是进入临床极其重要的一环，所以未来需要更多的体内外结合试验，为中药应用于临床提供更加充足的证据。鉴于多种中药无论单用或者联用抗菌素，在体内实验中都能起到很好的效果，且存在如黄芩苷这种对耐药菌无杀灭作用，而对BF有破坏作用的药物，这提示可能会有大量本身无抗菌作用或抗菌效果不明显的药物在联用抗菌素的时候可能会起到很好的效果，而又因其对菌本身无杀灭作用而不易产生耐药性，这可能是今后研究的方向之一。在临床上，应用于抗BF相关感染的中药制剂并不多见，今后还因将大量体外研究结果在动物模型中加以验证，将中药抗BF的研究结果转化为临床治疗方案，为临床抗BF相关感染这一问题提供更多的治疗选择，这将对控制BF相关感染性疾病产生重大影响，为世界各国的健康卫生事业带来巨大的收益。