干细胞移植治疗缺血性脑卒中的研究与进展

廖益东 王梓力 陈光唐 王旭东 徐卡娅

1贵州医科大学（贵阳 550004）；2贵州医科大学附属医院（贵阳 550004）

缺血性脑血管病已成为全球死亡及致残的主要原因［1］。我国每年有240万患者，110万患者死于脑梗塞，大约只有5%的患者能使用目前的治疗方法治疗。缺血性脑卒中主要是由一根或多根脑动脉阻塞引起的［2］。血液供应不足会降低脑细胞所需的葡萄糖和氧气，并破坏细胞内稳态，最终导致神经元死亡，从而导致神经功能的缺失。目前的治疗方法包括动静脉溶栓、血管内支架成形术、血管内介入治疗及外科手术等，但通常受限于梗塞治疗的时间窗（发病急性期4.5～6 h内）及严重的出血并发症［3］。尽管经使用上述的方法积极治疗后，许多患者仍然遗有残疾。急需开展新的基础或临床研究，以便能探索出一种更有效、更安全的治疗方法，可以提高患者生活质量，从而减轻社会医疗负担，这对我国国民经济的发展有重要意义。缺血性脑卒中的特征性变化是脑动脉闭塞后导致神经元的急性丧失以及突触结构的破坏［4］。由于神经细胞的更新能力有限且转换缓慢，内源性细胞替代不足以修复受损的神经元，因此干细胞疗法已成为治疗缺血性脑卒中最有前景的方法。干细胞是具有自我更新、高度增殖和多系分化的细胞群体，能够产生高度分化的功能子细胞，可以通过分泌各种神经营养因子和替换受损的神经元、通过抑制颅内外炎症反应和抗细胞凋亡发挥神经保护作用，还可释放细胞营养生长因子等增强內源性修复机制的物质而起到神经保护及修复的作用。

1 移植干细胞治疗脑卒中可能的作用机制

目前认为干细胞的作用机制可能有：（1）细胞的替代作用：恢复神经功能最直接的方法就是运用干细胞中新分化的神经细胞替换受损的组织。经研究证实，移植后的干细胞进入脑组织结构中，能够在特定条件下进行分化，代替损伤的神经细胞，促进神经的传导作用以及连接结构的重新建立。（2）促进血管生成：脑卒中的治疗不光需要神经组织的恢复，还需要开通血管，其中新生血管数量与患者的生存期呈正相关，因而提示血管再生是神经功能重构的重要机制。ZHANG等［5］发现90 d内的血管体积从中风前的3%增加到中风后的5.7%，在梗死区周围也观察到了毛细血管生成。此外，干细胞还可以通过调节Notch1和免疫调节细胞等的表达，来发挥其在血管生成中的作用。所以干细胞有可能调动了机体免疫细胞的能力，如调节性T（Treg）细胞来达到其有益目的，这是今后研究的热点［6-8］。（3）免疫和炎症的调节作用：在脑缺血性卒中后，大量的巨噬细胞和小胶质细胞被动员起来，并持续聚集到损伤区域。这类细胞有两种表型，分别是M1和M2，表型为M1基因的小胶质细胞和巨噬细胞分泌促炎症细胞因子，抑制神经元、突触的再生，不利于神经功能恢复。而表型为M2基因的小胶质细胞和巨噬细胞能够减轻局部炎症反应，清除细胞碎片，并释放大量营养因子来促进血管、神经细胞重塑，从而实现神经功能恢复［9-10］。在最近研究中发现小胶质样细胞已经从培养的人类胚胎干细胞和诱导性多能干细胞衍生而来，说明干细胞可以促进小胶质样细胞增殖分化［11］。此外干细胞也可分泌抗炎细胞因子和调控少突胶质细胞介质释放，通过免疫介导作用减弱神经性炎症［12］。总体来说，干细胞极有可能是通过免疫调节，降低了颅内外炎症反应，调动有益的免疫细胞，来介导卒中后患者神经功能恢复。（4）抗凋亡作用：这种作用可能是通过调控血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子和神经生长因子等营养因子的表达来实现的［7，13］。移植干细胞治疗缺血性卒中的作用机制可能有促进血管生成、免疫调控、对抗细胞凋亡等。见图1。

图1 移植干细胞治疗缺血性脑卒中的可能作用机制Fig.1 The possible mechanism of stem cell transplantation in the treatment of ischemic stroke

2 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）

MSCs属于成体干细胞的一大类型，运用最为广泛，获取轻松，便于保存，同时MSCs还具有免疫源性低、多项分化潜能等优势。随着研究进展人们认识到，脑血管病的亚急性期，动脉闭塞后导致神经元急性丧失以及突触结构的破坏，干细胞能释放的高度分化的功能子细胞和生长因子，能降低内源性神经炎症，减少兴奋性的神经毒性，调控脑内微环境来指导小胶质细胞抗炎，从而起到神经保护及修复作用［14-15］。最新研究表明过度上调水通道蛋白4（AQP4）会引起血脑屏障的损坏，MSCs能够下调AQP4，来减轻血脑屏障的破坏，更加有益于病变部位新皮质的生成［16］。体内研究还表明，在缺血性脑卒中大鼠体内注射MSCs能减轻血脑屏障的渗漏，调控免疫系统和旁分泌机制来促进神经功能的恢复［17-18］。随后SAVITZ等［19］应用骨髓来源的自体干细胞群ALD-401通过颈内动脉注入稳定期缺血性脑卒中患者颅内血管，未出现任何的安全问题和紧急不良事件，验证了该自体MSCs对于临床患者是具有安全性的。笔者思考，颈内注射改变了原有血流动力学，大规模应用是否可能引发新的血栓，这都需要大量的基础实验和临床研究数据来提供有力证明。LEE等［20］也运用静脉途径注射自体MSCs，随访五年后得出，这种干细胞移植策略对脑卒中患者是安全和有效的。综上述研究，中枢神经系统及颅内外炎性反应在缺血性脑卒中的发生发展起着关键的作用，MSCs能通过迁移作用存活在缺血区域，同时发挥免疫调节作用来对抗脑卒中后颅内炎症反应，调节Treg细胞增殖，这种MSCs细胞治疗剂，可能在脑血管疾病治疗中发挥巨大潜力［7］。总体来看，干细胞要想大规模应用需要不同的实验方法以及不同国家的人群进行移植，获取可靠研究数据，并且还需妥善解决治疗时间窗、移植途径、细胞剂量等问题。目前临床运用主要的移植途径分为立体定位注射、外周血注射及脑脊液循环注射，目前研究表明，脑卒中急性期通过外周血注射的患者受益更大，因此，缺血性卒中的不同时间窗移植干细胞，来观察它的疗效是非常必要的［21-22］。相信随着干细胞治疗脑卒中的不断深入，局限性问题将在将会迎刃而解。

3 纳米材料在干细胞移植传递和调控中的作用

纳米颗粒（直径10～100 nm），因其尺寸和形状可调节，具有较大的表面积，有利于细胞或者分子（药物、抗体）附着及可携带多种生物配体。临床研究表明，使用聚合物涂层涂抹纳米颗粒表面，更加提高了生物利用度，正是由于材料的特性，超顺磁性氧化铁纳米颗粒（Surparamagnetic iron oxidenanoparticles，SPIONs）的导入才能实时监测治疗效果，成为干细胞移植治疗领域的又一重大发现［23-24］。另一方面纳米材料作为干细胞移植的传递体，更加有利于改善干细胞存活和归巢、调控干细胞的行为及诱导其分化、增强干细胞的旁分泌等［25］。目前干细胞移植最大难题就是真正迁移到靶区细胞数量少，纳米材料的应用增加了细胞的运载数量［26］。与此同时，纳米材料的生物特性可调节干细胞的行为和脑内局部微环境，从而提高移植干细胞体内存活率。其可能的原因如下，纳米材料附加了某些生物活性分子，而且自身也具有一定生物活性。据可靠研究表明附加的生物活性分子包括化学小分子药物、核酸类药物、肽类药物、干细胞因子等［27］，见图2。为了使干细胞能更好地运用于临床，需要开发多类型的新型材料、或者涂层材料搭载干细胞进入体内发挥作用。

图2 附加于纳米材料的各类活性分子、药物的负载方式Fig.2 Loading methods of various active molecules and drugs attached to nanomaterials

4 移植后干细胞追踪方法及临床应用 磁共振成像

MRI是干细胞移植临床追踪的最有前途的无创成像方法之一。为了通过MRI追踪移植的干细胞，需要使用造影剂标记，以获得足够的信号强度差异，才能在MRI显示出来。经过多项研究发现超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒成为干细胞标记的首选［28］。研究发现，具有中空结构的锰磁性纳米粒子（MnOHo）并用β1抗体对其进行了修饰，在干细胞注射前使用预先进行标记，注射进小鼠体内后通过MRI检测，MnOHo依然存在于标记的干细胞中，证明了MnOHo对转基因干细胞具有生物安全、高效标记，多重检测的优点，从而能够在临床前对移植的人类干细胞进行微创监测［29］；ZHANG等［30］还向卒中小鼠的大脑内注射了荧光介导的二氧化硅涂层来包裹SPIO，标记的干细胞，发现荧光修饰的SPIO对干细胞进行了高效的跟踪，这种方法有望在MRI应用中取得巨大成功。然而，又有报告指出SPIO的局限性就是随着细胞分裂的进行，SPIO的浓度会减半，导致信号减少，影响MRI结果的准确性，这对长期追踪造成了很大的阻碍［31-32］。总体而言，MRI虽然具有非侵入性的优点，但是标记物容易随着细胞的分裂而削弱，需要和纳米颗粒或基因修饰进一步整合，提高它的特异性，以便更加适合其临床应用，这是未来干细胞成像的新趋势。

5 思考与展望

2014年“干细胞及转化研究”被列为国家重点研发计划，为干细胞治疗缺血性卒中提供了丰富的理论依据和技术支持。然而，目前干细胞应用于缺血性卒中治疗的临床试验大多数都是短期案例研究，缺乏长期的全面的临床数据分析。但是大量的动物试验已经证实了干细胞治疗缺血性脑卒中的一个可行性、安全性和先进性，如何将动物试验与临床应用结合是目前棘手的问题。现如今，干细胞治疗脑缺血性卒中的机制仍不明确，还可能存在的机制如：干细胞是如何将健康线粒体定向归巢至靶细胞以挽救受损细胞，从而调控免疫细胞，减轻了颅内外源性炎性反应，这些修复的机制还有待深入研究。随着我们国家人民对医疗水平的需求，还需要结合临床实践经验，思考注射的干细胞剂量对患者的疗效，以及适宜时间窗的选择及移植途径等问题。最新研究表明可采用纳米新型材料搭载移植干细胞，该材料具有很多优势，不仅减少了干细胞损失率、还调控了颅内微环境，让更多的干细胞到达受损靶点发挥治疗效应。但是递送干细胞药物产品的临床运用可能存在免疫排斥，生物相容性、血管化等问题仍然面临挑战。未来干细胞的成功运用，不仅需要到临床实践中发现问题，而且还要不断的回归到基础研究中解决问题，这样才能为颅内移植干细胞治疗神经系统疾病提供新的理论依据，为缺血性脑卒中防治提供潜在的应用靶点。