树突状细胞疫苗治疗口腔鳞状细胞癌的研究进展

裴天楚 黄隆 吴国惠 潘文娜 刘嘉敏 潘宣

广东药科大学附属第一医院口腔科（广州510080）

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinomas，OSCC）在头颈部恶性肿瘤中发病率最高。肿瘤早期的患者通常接受手术治疗，3年有效生存率可达92.2%（SE = 1.1），而晚期肿瘤患者接受手术协同放疗或化疗的综合治疗，3年有效生存率只有70.3%（SE = 1.9）［1］。免疫治疗作为一种新的治疗方案，一方面可以直接补充外源性免疫效应细胞或分子，提高机体内免疫应答水平，另一方面利用肿瘤免疫的机制和特点，改变肿瘤细胞或效应细胞的免疫学特性，调整机体免疫应答的状态，达到抑制或杀伤肿瘤的目的［2］。目前树突状细胞疫苗在治疗一些如黑色素瘤、胃肠道肿瘤、淋巴瘤等肿瘤的过程中取得了可观的效果［3-4］。

1 树突状细胞是最活跃、扮演角色最多的免疫细胞

树突状细胞（dendritic cells，DC）由单核细胞分化而来，是人体内抗原呈递能力最强的免疫细胞［5］。按来源可分为髓系DC（myeloid DC，mDC）和浆细胞样DC（plasmacytoid DC，pDC）两个亚群，在整个免疫应答过程中起着至关重要的作用。pDC 主要通过辅助性T 细胞介导的Ⅰ型免疫应答，在固有免疫中发挥重要作用［6］。mDC 在摄取处理抗原后可迁移至二级淋巴组织，从而启动免疫应答并刺激分泌相关免疫因子参与免疫应答的环节［7］，制备疫苗选用的mDC 通常由骨髓分离出的单核细胞诱导分化而来。且树突状细胞膜上表达MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子，像自然界的蜜蜂一样在免疫系统里扮演传播抗原的媒介角色。未成熟DC 具有很强的抗原摄取及加工能力。当未成熟DC 在摄取抗原或经肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）等刺激后逐渐成熟，并表达共刺激因子（CD80/B7-1、CD86/B7-2 等）和黏附因子，使得抗原呈递和激活初始T 细胞的能力增强。DC 还可以提供T 细胞活化所必须的第二信号，增强NK 细胞毒作用等［8-9］。

2 树突状细胞在OSCC 患者体内处于免疫抑制的状态

免疫系统与肿瘤之间的关系可概述为免疫编辑的三个阶段：消除、平衡和逃逸［10］。免疫系统能够检测并消除新出现的恶性细胞，防止它们不受控制地扩散。癌症免疫监视是重要的宿主保护方式，可抑制细胞癌变以及维持正常细胞处于稳定的状态。恶性肿瘤细胞可通过以下的机制逃避免疫监视：（1）免疫识别降低（包括肿瘤抗原表达水平降低和MHC、共刺激分子表达的丧失）；（2）通过STAT-3 信号传导增加肿瘤细胞对凋亡的抗性；（3）细胞因子如血管内皮生长因子、TGF-β、白介素-10 的分泌和免疫调节分子如PD-1/PD-L1、TIM-3、LAG-3 的表达增加，均导致了恶性肿瘤的进展［11］。在肿瘤微环境中的树突状细胞功能受到明显的抑制。HILLY［12］证实位于肿瘤周围微环境和肿瘤瘤体内的抗原呈递细胞和淋巴细胞处于一个低表达的水平，与此同时在OSCC 中的树突状细胞占比明显低（11.7/HPF vs.25.0/HPF）。

树突状细胞与细胞的恶变和恶化有着密切的联系，树突状细胞在调节先天性和适应性免疫以及抗肿瘤免疫中扮演了重要角色［13］。在头颈部鳞癌（HNSCC）以及其他系统肿瘤中，树突状细胞的免疫能力同样受到不同程度的抑制。不同于MHC-Ⅰ类分子和MHC-Ⅱ类分子，CD1a 也是一种抗原递呈分子，主要在抗原递呈细胞（APC）表面表达［14］。肿瘤周围CD1a+标记的树突状细胞耗竭是一个独立影响预后的因素，预示着更差的生存结果和更高的复发率［15］。在OSCC肿瘤间质中检测到高水平浆细胞样树突状细胞（pDC），但在对照组正常的口腔粘膜中却很少或未检测到pDC。机体带瘤状态下IFN-α、IL-6 和TNF-α等免疫因子分泌减少，造成pDC的数量减少和功能受损，从而导致更高的机率发生淋巴结转移以及总生存率的显著降低［16］。OSCC 患者癌组织中肿瘤浸润性树突状细胞的密度、MHC-Ⅱ阳性以及CD54 阳性的细胞比例均降低，肿瘤直径越大、肿瘤分期越靠后，肿瘤浸润性树突状细胞的表达水平越低［17-18］。

3 树突状细胞疫苗在治疗OSCC 过程中的探索

在树突状疫苗的初步探索阶段，单次注射抗原脉冲DC 的制备疫苗足以在体内诱导抗原特异性免疫反应。树突状细胞疫苗治疗OSCC 最早由WANG［19］用Tca8113 细胞裂解物刺激人类外周血单核细胞培养出的树突状细胞，激活自体的T 细胞，在体外进行MTT 分析结果显示其对肿瘤细胞杀伤作用有效，并向荷瘤裸鼠给药，发现推迟了裸鼠体内瘤体的倍增时间（P＜0.01），即在体内外肿瘤细胞的生长均受到了有效地抑制（P＜0.05）。国内最早有报道将外周血中提取的单核细胞，以免疫因子诱导成为成熟的树突状细胞，并接受肿瘤裂解物脉冲刺激，再与T 淋巴细胞混合培养来诱导出特异性细胞毒性T 细胞（CTL）。相比对照组，肿瘤细胞裂解物脉冲刺激DCs 能更有效地抑制肿瘤生长及延长肿瘤倍增时间（P＜0.05）［20］。

以往树突状细胞疫苗的制备通常采用自体外周血单核细胞诱导分化成树突状细胞与单一的特异性抗原肽或者肿瘤裂解产物进行共培养的方法，这种方法制备的疫苗免疫原性较低，为了提高树突状细胞摄取处理抗原的能力，GAO［21］实验证实利用纳秒脉冲电场（nsPEF）技术，采用适当电场强度能增强树突状细胞对肿瘤抗原的摄取与递呈能力，并且激活了更多的效应细胞。树突状细胞在肿瘤的免疫治疗中具备天然的优势，WHITESIDE［22］用自体肿瘤凋亡抗原负载制备树突状疫苗，用于Ⅲ/Ⅳ期头颈部鳞状细胞癌患者，接种疫苗的患者长期无病生存率得到明显提高，表明该疫苗有免疫原性且具备一定的安全性。DC 的直接瘤内给药并结合放射治疗，不仅可以对直接给药的局部肿瘤产生强烈的抗肿瘤作用，通过激活GRP94/gp96 途径，还可以对未治疗的远处肿瘤产生一定的抗肿瘤作用，即出现抗肿瘤的异位效应。但是皮内给药途径显示，DC 向淋巴结的迁移率降低，经超声引导的DC 疫苗接种又可能存在将疫苗注射到脂肪区域（瘤体外）的弊端［23］，所以影像医生辅助疫苗接种将是一个很好的选择。当受到宿主免疫系统攻击时，肿瘤相关抗原可通过泛素化途径在蛋白酶体中降解短寿蛋白（包括DRiPs），维持肿瘤细胞长期稳定生存的状态。肿瘤细胞通过MHC-I 类分子递呈的抗原多来自于自身降解的DRiPs（有缺陷的核糖体产物）。有研究用自噬诱导剂、蛋白酶体抑制剂、溶酶体抑制剂等处理OSCC细胞，诱导分离出大量自噬性抗原Dribbles（包含大量DRiPs 的泡状自噬体），并用其负载DC，抗肿瘤效果要显著优于肿瘤裂解产物脉冲刺激所制备的疫苗［24］。外泌体是一种纳米级的细胞外小囊泡（30 ～150 nm），包含复杂的RNA 和蛋白质以及其他代谢物组分，广泛应用于机体的免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭、体液调节等，被认为是细胞间通讯的重要介质［25］。树突状细胞外泌体同样具有抗原提呈和激活CD8+T 细胞的能力［26］。戴欣悦［27］利用免疫检查点抑制剂外体偶联树突状细胞外泌体疫苗治疗黑色素瘤，相比对照组抑制了原发癌的复发和转移，并减弱了靶外效应，促进了免疫检查点抑制剂的稳定。树突状细胞表面高表达甘露糖受体，壳聚糖-硬脂酸（stearic acid-grafted chitosan，CtSa）是一种糖脂嫁接后得到的产物，将甘露糖嫁接到CtSa可以得到MCt-SA（mannose modified stearic acid-grafted chitosan）。MCtSA 是一种较强的免疫佐剂，在模拟抗原捕获试验中有出色的表现。体外细胞摄取试验证实［28］，甘露糖的靶向修饰后可促进DC 对MCtSA 的摄取，以此制备糖脂钠米疫苗，提高了MHC-I 分子抗原呈递能力，同时也增强了抗肿瘤效应。

4 树突状细胞疫苗治疗过程中存在的瓶颈以及新的尝试

当机体长期遭受肿瘤侵袭，机体免疫环境发生变化，免疫系统处于被抑制的状态，树突状细胞的免疫能力相应出现下降，从而发生肿瘤细胞免疫逃逸现象。树突状细胞疫苗在体内外抗肿瘤的成果是有目共睹的，例如该疫苗在体外能有效地杀伤肿瘤细胞、使接种肿瘤裸鼠瘤体的倍增时间延长等。但当树突状细胞制备的疫苗接种到患者体内时，由于树突状细胞疫苗本身具有免疫原性容易激活自身免疫反应，从而使得疫苗未能达到预期的治疗效果［29］。

许多研究者为了使树突状细胞疫苗能更准确的在患者肿瘤部位发生效力，通过研究发现标靶肿瘤瘤体内高表达蛋白是一种可靠的方法。HARDWICK 等［30］发现头颈部鳞癌患者肿瘤细胞中存在P53 肽的蓄积，该试验使用P53 蛋白标靶树突状疫苗，证实了被标靶的疫苗可在体内有效地迁移。由此设计的Ⅰ期临床实验，在16 例患者中有11 例（69%）患者接种P53 肽标靶的疫苗后，体内特异性T 细胞的数量和IFN-g 的分泌量增加以及调节性T 细胞（Treg）的水平持续下降，而调节性T 细胞通常被认为可能会阻断抗肿瘤反应。但是该实验的样本量很少，需要开展大样本量的Ⅱ-Ⅳ期随机临床实验，寻找肿瘤周围异常蓄积的肽或其他可以稳定结合的基团，可能会使得疫苗更有效地迁移。肿瘤靶点的研究依旧是当下抗肿瘤药物研究的热点话题，表皮生长因子受体的过表达在头颈部鳞状细胞癌以及其他系统肿瘤中很常见。利用重组纯化谷胱甘肽-S-转移酶（GST）-EGFR 融合蛋白［31］，脉冲处理小鼠的树突状细胞制备成疫苗，并评估该种方法制备的疫苗引起的细胞毒性T 淋巴细胞反应、干扰素分泌水平、肿瘤生长速度和小鼠存活率等，相比对照组，实验组接种GST-EGFR融合蛋白脉冲DC疫苗的小鼠在体外和体内均显示出了明显的抗肿瘤效应（P＜0.05）。有研究指出卵泡抑素样蛋白-1（FSTL-1）在许多肿瘤中可观测其过高或过低表达，FSTL-1 可通过改变核因子kb 和Jun-N 末端激酶的表达从而提高鼻咽癌患者树突状细胞的免疫效力［32］，但需要相关研究证实OSCC患者中该蛋白的表达水平或相关信号通路及调控环节。

5 小结与展望

提高树突状细胞疫苗有效迁移能力的同时仍需提高树突状细胞本身的免疫能力，二者结合可能会提高树突状细胞疫苗的效力，逆转其在体内免疫抑制的状态。目前学术研究在了解基因组和免疫关系方面取得了一些进展，但迄今为止临床上有用的生物标记物很少，并且需要系统评估肿瘤细胞的异质性、免疫微环境的变化以及宿主的个体因素［33］，对疫苗的改进带来巨大的挑战。很多免疫、肿瘤学家将肿瘤的免疫治疗视为“失败的假设”，对免疫系统和网状树突状细胞系统认知不够全面系统深入依旧是当前主要问题。如能发现更有效的免疫因子佐剂来提高树突状细胞的摄取处理递呈抗原能力，或刺激分泌下游的免疫因子，从而调控整个免疫应答过程；找寻并标靶更有效生物标记物，或筛选基因片段重组质粒转染树突状细胞，从而改变疫苗迁移的生物行为；使用外泌体作为疫苗的载体并联合使用免疫检查点抑制剂等，为改进疫苗提供了不同的视角。随着人们对免疫系统的深入认识以及对树突状细胞亚群特性方面的掌握，相信未来树突状细胞疫苗会在口腔肿瘤的临床治疗中更为广泛地受到应用并为患者带来新的希望。