西方许旺酵母及其工业应用概述

孟 秋，章亭洲

（浙江科峰生物技术有限公司，浙江 海宁 314400）

1909年，Kloecker在西印度群岛的圣托马斯岛首次分离到一类子囊孢子酵母，并将其命名为西方许旺酵母（Schwanniomyces occidentalis）。随后Schw castellii、Schw alluvius和Schw persoonii也逐渐被分离出来，虽然他们的发酵特性和西方许旺酵母有较明显的区别，但C. W. Price 等基于DNA 重组试验分析将以上四种菌统一命名为Schw occiden⁃talis。 其 中Schwo ccidentalis、Schw castellii和Schwalluvius的序列同源性超过97%，称为西方许旺酵母西方变种（Schw occidentalis var. occidenta⁃lis）；而Schwpersoonii与Schwoccidentalis的序列同源性仅有80%左右，称为西方许旺酵母皮尔松变种（Schw occidentalis var.persoonii）[1]。

许旺酵母属（Schw anniomyces）是酵母科内孢子目的一个成员，它同被广泛研究的酵母属、克鲁维酵母属和汉森酵母属一样，均属于酵母亚科[2]。西方许旺酵母最引人注意的特征之一在于它可以分泌α-淀粉酶和糖化酶，对淀粉进行高效降解，这也是西方许旺酵母在工业生产中的重要应用之一。

1 西方许旺酵母生理生化特征

1.1 形态特征

在YM 固体培养基中25 ℃培养3 d 后，西方许旺酵母细胞呈圆形及卵圆形，细胞大小为3～8 μm×3～10 μm；菌落为圆形、凸起、乳白色；可形成假菌丝，产生1个长弯曲形子囊孢子，这也是它有别于其他子囊菌孢子的一个重要特征[2]。

1.2 代谢特征

西方许旺酵母能够利用多种有机化合物作为碳源，如葡萄糖、果糖、半乳糖、D-木糖（后两者不能被皮尔松变种同化吸收）、蔗糖、棉籽糖、纤维二糖、海藻糖、乳糖（某些菌株）、琥珀酸酯、柠檬酸酯、乙醇、正构烷烃（皮尔松变种除外）、麦芽糖、异麦芽糖、糊精以及可溶或者原淀粉等。需要注意的一点是，蜜二糖并不能被该属细菌利用，也不能在不含维生素的培养基上生长，且无硝酸盐呼吸能力[3-4]。植酸酶能够将肌醇六磷酸酯转化成无机磷酸盐和肌醇单-五磷酸盐，目前认为，西方许旺酵母中植酸酶活性在所有酵母菌中是最高的，且该属菌株能够以肌醇六磷酸酯为唯一磷酸来源进行生长[5]。

西方许旺酵母的呼吸作用不受高糖浓度的抑制，并且在有氧条件下几乎不会进行发酵[6-7]。这也说明它没有明显的葡萄糖效应，并表现出较强烈的巴斯德效应。C.Poinsot等[8]分离出一株细胞色素b合成缺陷的许旺酵母，与出发菌株不同的是，该菌株表现出明显的葡萄糖效应，且巴斯德效应降低，表现为在相同的有氧条件下发酵速度显著增强。表明西方许旺酵母呼吸替补通路的存在。

1.3 生命周期

西方许旺酵母细胞呈卵形（3.5～8.0 μm×4.5～9.0 μm），无性繁殖方式为出芽繁殖，假菌丝体呈不规则形态[9]。细胞一般以单倍体形式存在。许旺酵母属细胞间不能发生基因融合重组，但母细胞和子细胞在形成子囊孢子前可发生融合。电子显微镜观察发现，母细胞与子细胞融合后，首先被细胞壁分隔开，进而进行核融合，并进一步在母细胞中发生减数分裂。融合后的母细胞会在融合部位的细胞壁上出现一个黑色的环，有时也可以通过细胞壁接触区域的残留来加以区分。许旺酵母通过形成一个或两个核桃状的子囊孢子进行有性繁殖，它们一般为宽而平的长突起。也有研究表示，皮尔松变种形成的赤道环和突起可能与其他许旺酵母有所区别[10]。从许旺酵母整个生命周期来看，二倍体的出现是核融合的结果，此时的细胞更利于在不良条件下生存[11]。

2 西方许旺酵母培养基的选择

西方许旺酵母与酿酒酵母的完全培养基（YPD培养基）和基本培养基（SD 培养基，以葡萄糖为碳源）相同。其中YPD 培养基组分为1%的酵母膏、2%蛋白胨和2%的葡萄糖。西方许旺酵母的最小基本培养基需含有酵母基础氮源以及所需氨基酸和碳源，可将其溶解于0.2 mol·L-1Na2PO4（pH 值为6.3）的缓冲液中，以维持淀粉酶的活性。

不同培养基对酵母孢子形成的诱导效率不同。用酵母提取物或葡萄糖琼脂培养基室温培养5 d后，可诱导西方许旺酵母孢子形成。A. P. James等[12]配制含有1.3%的酵母提取物、0.5%的蛋白胨和1.5%的葡萄糖培养基，pH 值调整为4.5，9 ℃下培养20 d后观察到酵母孢子形成。酵母麦芽提取物琼脂培养基上也可产芽孢[11]。

3 西方许旺酵母的原生质体融合

J.J.Wilson 等[13]通过聚乙二醇诱导营养缺陷型突变体的原生质体融合，从而产生重组菌株。有些重组子是不稳定的异核体，有些重组子是稳定的二倍体（或非整倍体），它们可以和新的营养缺陷型菌株发生有丝分裂。通过添加对氟苯丙氨酸可以增加有丝分裂频率。减数分裂不会改变杂交种的倍性，因此原生质体融合是构建许旺酵母多倍体菌株的有效方法，并可用于互补试验中突变体的特性描述，甚至用于减数分裂的遗传特征分析。然而，原生质体融合似乎并不能产生具有新标记的单倍体重组子[13-14]。

西方许旺酵母细胞的原生质体可以在溶胞酶、解旋酶、蜗牛酶、β-葡萄糖醛酸酶或非水溶性葡聚糖酶的作用下产生[12-16]。

西方许旺酵母的转化方法和其他酵母菌（如酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酵母和汉逊酵母）相同[17]。此外，许旺酵母还可进行电转化以及醋酸锂介导的酵母细胞高效转化[18-19]。

4 西方许旺酵母的淀粉分解系统

α-淀粉酶可水解淀粉分子的α-1，4 糖苷键。研究表明，西方许旺酵母分泌的α-淀粉酶同时具有α-1，6 糖苷键水解活力，可在与糖化酶的协同作用下快速降解淀粉[14，20-21]。

通过构建许旺酵母α-淀粉酶基因缺失突变株（ΔGAM1），发现其仍然能够在含有淀粉或以支链淀粉作为唯一碳源的培养基上生长，尽管生长状况和淀粉水解能力显著降低。这一现象产生的原因是许旺酵母胞内存在其他活性较低的淀粉水解酶。尽管如此，GAM1显然是发挥淀粉酶活性的主要功能酶[22]。

α-淀粉酶基因的表达受到严格的调控。西方许旺酵母中α-淀粉酶编码基因AMYl、SWA2 以及GAMl 基因都会受到葡萄糖抑制[23-24]。在葡萄糖匮乏时，α-淀粉酶和糖化酶的表达受麦芽糖、可溶性淀粉和棉籽糖等的诱导，且对温度高度敏感（37 ℃时被抑制）[25-26]。当pH值低于3.5或温度高于55 ℃时，西方许旺酵母中的α-淀粉酶和糖化酶均会失活，60 ℃以上时该酶被不可逆抑制。

由于在厌氧条件下糖化酶和α-淀粉酶的表达受到抑制，许旺酵母不能在麦芽糖和淀粉培养基中进行代谢，因此表现出明显的克拉布特里效应[27-30]。虽然西方许旺酵母可表达麦芽糖渗透酶和α-葡萄糖苷酶，但在待测菌株中淀粉酶活性似乎是影响麦芽糖利用率的限速酶。葡萄糖是淀粉酶的产物之一，同时也是其表达的抑制物。这一反馈调节作用也解释了生长稳定期该酶表达活性较高的原因[25,31]。静止期时，底物水解产生的葡萄糖不足以达到抑制浓度，葡萄糖淀粉酶的表达可以不受抑制地进行；在含有2%可溶性淀粉的培养基中，通过增加淀粉酶编码基因GAM1的拷贝，使培养基中葡萄糖浓度迅速增加，这将对GAM1造成反馈抑制，直到葡萄糖浓度降到足够低的水平，从而进行新一轮的诱导表达。

5 西方许旺酵母的工业用途

5.1 在工业乙醇生产中的应用

在工业乙醇的生产中，玉米等淀粉原料经研磨、“糊化”和“液化”作用，继而在α-淀粉酶和糖化酶的作用下进行“糖化”。“糖化”产生的糖类物质进一步通过酿酒酵母发酵产生乙醇。在酿造啤酒或生产麦芽威士忌等的过程中，由于一些不可发酵的麦芽糊精的存在，使得淀粉的糖化效率低。为了降低产品中糊精的含量，通常引入西方许旺酵母来提高糖化效率。一方面，可以通过外源添加西方许旺酵母来源的高效降解酶[32]；另一方面，将西方许旺酵母来源的淀粉高效降解基因在酿酒酵母中进行异源表达。在酿酒酵母中异源表达西方许旺酵母的α-淀粉酶和糖化酶，已经基本实现了淀粉的完全水解[33-34]。

5.2 在烟草增香提质方面的应用

烟草中的类胡萝卜素是烟草香气成分的重要前体物质。类胡萝卜素在进行氧化降解时，由于双键断裂的位置不同可形成不同的产物，并进一步产生不同的香味物质。西方许旺酵母可以降解类胡萝卜素，生成β-紫罗兰酮、β-环柠檬醛、2,2,6-三甲基环己酮和二氢猕猴桃内酯等香味物质[35]。

国内外学者对烟草发酵过程中的微生物进行了分离鉴定，发现烟叶表面分离得到的西方许旺酵母接种量影响烟叶复烤后香气组成[36]。郑坚强等[37]通过分析西方许旺酵母双加氧酶的添加量、发酵温度和发酵时间对烟草增香效果的影响，确定了实验室条件下利用西方许旺酵母进行烟叶增香的最佳条件。

5.3 在油脂生产方面的应用

伴随着生物技术的发展，人们对微生物产油的研究越来越多。产油微生物能够以脂质形式积累油脂达其自身总生物量的20%（w/w）以上，是工业化油脂生产的重要载体[38]。西方许旺酵母是产油酵母的一种，能够利用广谱糖类（C5 和C6）进行产油发酵，并能够产生高达其总生物量42%的脂肪酸[39]。为了得到酵母胞内生产的油脂，可以采用化学或物理的方法破坏细胞壁，然而这些方法往往造成油脂提取效率低以及副产物易受到破坏。目前R.Heshof等[40]发明了一种有效的温和酶解方法来破坏细胞，以促进从西方许旺酵母中提取脂质。

含脂质的多不饱和脂肪酸具有良好的营养价值，有利于健康，并与减少动脉粥样硬化、炎症和致癌作用相关联。人类和其他高等动物无法合成某些多不饱和脂肪酸，例如亚油酸，它们依赖于日常中摄取的饮食（如豆油和亚麻籽油）来获取。D.Lamers 等[41]通过过表达Δ12-去饱和酶，大大提高了西方许旺酵母中多不饱和脂肪酸含量，尤其是亚油酸的产量.

6 总 结

西方许旺酵母具有不同于酿酒酵母等的生理生化特点和优势。其中，西方许旺酵母分泌的α-淀粉酶不仅具有α-1,4 糖苷键水解活力，还可部分代替糖化酶的功能，使淀粉得到高效水解。淀粉的原材料来源广泛且价格低廉，在工业生产中可替代价格较为昂贵的糖蜜。西方许旺酵母高效水解淀粉的能力也使其用作饲料酵母单细胞蛋白，作为优质蛋白源部分或全部替代鱼粉和肉骨粉等。此外，西方许旺酵母在烟草增香和油脂生产方面也具有巨大潜力。伴随着微生物在工业生产方面的研究发展，西方许旺酵母必将具有更加广阔的应用空间。