APP下载

猪细小病毒病灭活疫苗纯化浓缩技术研究

2021-01-10李应鹤初晓红

饲料博览 2021年8期
关键词:浓缩液中空原液

李应鹤,初晓红,宋 扬,徐 刚,李 贽,于 镭

(哈药集团生物疫苗有限公司,哈尔滨 150069)

猪细小病毒病是危害全球养猪业的三种重要传染病之一,给养猪业带来了巨大的经济损失。因此,为了预防和控制这类疾病,应用安全、高效的疫苗是最主要的解决途径。为了探索浓缩纯化后的病毒液的免疫效果,本试验拟采用中空纤维柱浓缩纯化技术对猪细小病毒L株灭活病毒液进行过滤纯化,并制备成灭活疫苗进行安全与效力检验[1-2]。

1 材 料

1.1 制苗用病毒液

猪细小病毒L株灭活病毒液(灭活前病毒液红细胞凝集价为1∶512,病毒含量为107.36TCID50·mL-1),由哈药集团生物疫苗有限公司制备和提供。

1.2 主要试剂

MontanideTMISA 206 VG佐剂,购自法国赛比克公司;2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA),购自Sigma 公司;0.02 mol·L-1PBS、氯仿等原料,购自国药集团;其他试剂均为国产分析纯级。

1.3 红细胞凝集抑制抗原

猪细小病毒L株,批号为PPV-HI Ag-201401,红细胞凝集价为1∶512,规格为1.0 mL·瓶-1,由哈药集团生物疫苗有限公司制备和提供。

1.4 中空纤维超滤浓缩系统

中空纤维超滤浓缩系统,华泰净化技术工程有限公司提供。

1.5 红细胞悬液

0.5%豚鼠红细胞悬液,按现行《中国兽药典》制备。

1.6 试验动物

2~4日龄豚鼠,体重350~400 g,猪细小病毒HI抗体效价低于1∶8,由哈药集团生物疫苗有限公司实验动物中心提供;1.5~2 月龄的仔猪(猪瘟中和抗体阴性、猪细小病毒HI 抗体不超过1∶8),购自黑龙江省哈尔滨市郊某猪场,品种为长白。

2 方 法

2.1 病毒液纯化与浓缩

2.1.1 病毒液澄清

按程序安装澄清用的0.45 μm的中空纤维柱及管路,用25%乙醇清洗中空纤维柱内的保存甘油,再用纯化水冲洗,然后以2%NaOH 循环清洗中空纤维柱并浸泡过夜,再用纯化水清洗中空纤维柱内残留碱液至中性并测定水通量,用PBS平衡中空纤维柱。无菌连接中空纤维柱的进液、回液与透过液,将病毒液进行澄清处理。

2.1.2 中空纤维浓缩纯化

安装规格为100 ku 中空纤维柱及管路,再用2%NaOH 循环清洗中空纤维柱并浸泡过夜,然后用纯化水冲洗中空纤维柱内残留碱液至中性并测水通量。用无菌PBS平衡中空纤维柱。无菌连接中空纤维柱的进液和回液后进行浓缩处理,处理时保持泵转数在15%~20%。每批样品分别浓缩20倍,用PBS连续洗滤浓缩液2~3次,以洗滤出液体计算洗滤次数。

2.1.3 病毒液重悬

按猪细小病毒原液量1/2 体积(即相当于最终进行2倍浓缩)加入PBS溶液,重悬后即得2倍浓缩的病毒液。

2.2 疫苗配制

分别用猪细小病毒灭活原液和2倍浓缩液分别配制3 批疫苗。原液配制的3 批疫苗批号分别为YY-201401、YY-201402 和 YY-201403,2 倍浓缩液配制的3 批疫苗批号分别为NS-201401、NS-201402和NS-201403。

2.3 检测

2.3.1 红细胞凝集价的测定

分别对猪细小病毒原液、2倍浓缩液以及中空纤维浓缩滤过液进行红细胞凝集价的测定。

2.3.2 安全检验

用乳鼠检验:用2~4 日龄乳鼠30 只,随机分为6 组,每组5 只,各经皮下注射疫苗0.1 mL,设条件相同的对照乳鼠5只,相同环境下饲养,观察7 d[3]。

用猪检验:用断奶后1.5~2月龄猪12头(猪瘟中和抗体阴性、猪细小病毒HI 抗体不超过1∶8),随机分为6组,每组2头,各经深部肌肉注射疫苗5 mL,设条件相同的对照猪2 头,相同环境下饲养,观察21 d。

2.3.3 效力检验

用体重350~400 g 猪细小病毒HI 抗体效价低于1∶8的豚鼠30只,随机分为6组,每组5只,分别肌肉注射疫苗0.5 mL。28 d后连同条件相同的未注射对照豚鼠2只,采血,测定HI抗体效价。

3 结果与分析

3.1 红细胞凝集价测定结果

从浓缩前后红细胞凝集价测定结果看,猪细小病毒原液与2倍浓缩液红细胞凝集价无差异。

3.2 安全检验结果

从疫苗的安全检验结果可以看出,猪细小病毒原液配制的疫苗和2倍浓缩液配制的疫苗在安全检验上都是安全的,但从本动物安全检验体温检测指标上比较,原液配制的疫苗一过性体温总体要高于2倍浓缩液配制的疫苗。

3.3 效力检验结果

从疫苗的效力检验结果上看,两种疫苗免疫豚鼠,各组免疫豚鼠有5/5出现抗体反应,其HI抗体效价均不低于1∶64。

4 结 论

验证的纯化浓缩工艺采用0.45 μm的中空纤维柱去除细胞碎片,采用规格为100 ku空纤维柱对猪细小病毒原液做20 倍浓缩,然后按不低于原液量1/2 体积的PBS 液重悬后作为浓缩抗原。用猪细小病毒原液和2倍浓缩液分别配制疫苗,对两种疫苗的安全检验、效力检验结果进行比较。结果显示,上述两种疫苗安全检验、效力检验结果均符合规定,但2倍浓缩液配制的疫苗安全性明显优于原液制备的疫苗,证明该纯化浓缩工艺是有效可行的。

猜你喜欢

浓缩液中空原液
中药醇沉前浓缩液质控指标的完善及标准建立——以党参醇沉为例
铁氧化物改性聚丙烯腈中空纤维膜的制备及其对亚甲基蓝的去除性能
高品质原液着色聚酯技术又一项国家重点研发计划项目获批立项
不同香型再造烟叶浓缩液化学成分和微生物组差异性研究
血液透析浓缩液保护盖的制作与应用
化纤联盟彰显科技担当
碳与陶瓷复合中空纤维膜的制备及其处理含碘废水性能的研究
垃圾渗滤液膜过滤浓缩液处理工艺探讨
一种在线黏度检测装置及实现方法
衡水老白干67度原浆原液的两款酒比较谈