新型冠状病毒肺炎尸检样本中福尔马林色素的识别与消除

段 裴，刘旭光，付 冉，蔡航航，刘泰文，许三鹏

2019年底至今肆虐全球的新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)已经造成全球7 512万余人感染[1]。新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)尸检样本是珍贵并极具价值的诊断和研究材料。2020年2～3月华中科技大学同济医学院附属同济医院病理研究所与同济医学院法医学系共同完成了9例COVID-19尸检工作。在病理诊断与研究过程中，首先在部分免疫组化切片中发现了棕褐色大小不等的圆形球状颗粒。这些棕褐色颗粒对免疫组化结果判读造成了困扰。复习HE切片时，发现在相同位置存在类似的棕黑色颗粒分布，需与肺部的碳颗粒、含铁血黄素颗粒、脑的脂褐素、肝脏的胆色素等色素鉴别。综合分析认为这些棕褐色、棕黑色近圆形颗粒更像是福尔马林色素。查阅文献[2]后使用消除福尔马林色素的方法对相关切片进行处理，发现经处理后相关色素消失，证明了最初的推断。现对相关实验方法、处理经验介绍如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源收集2020年2～3月华中科技大学同济医学院附属同济医院病理研究所和同济医学院法学系共同尸检的9例COVID-19，尸检组织行HE染色，镜下观察。取其中1例COVID-19尸检样本的心、肝、脾、肺、肾等组织和1例非COVID-19子宫肌瘤手术样本(对照组织)制备组织芯片，进行脱色素和相关实验。

1.2 试剂配制50 mL氨水加入350 mL无水乙醇，使用蒸馏水补足500 mL，得到10%氨水乙醇溶液。Ki-67(UMAB107，1 ∶400稀释，北京中杉金桥公司)，免疫组化二抗系统(EnVision K8002，DAKO公司)。HE染色使用日本樱花全自动HE染色与封片系统进行，Ki-67免疫组化染色在DAKO公司AUTOSTAINER LINK48自动免疫组化仪上进行。

1.3 方法(1)观察9例COVID-19尸检样本HE染色切片中心、肝、脾、肺、肾等组织中福尔马林色素存在状态。(2)取其中1例COVID-19心、肝、脾、肺、肾等样本和1例非COVID-19子宫肌瘤组织(组织对照)，制作成多组织芯片蜡块。多组织芯片蜡块常规4 μm厚连续切片5张。取第1张多组织芯片行常规HE染色。第2张多组织芯片常规脱蜡后，使用10%氨水乙醇溶液室温(25 ℃)浸泡20 min，流水冲洗5 min后行常规HE染色，以明确脱福尔马林色素操作对HE染色结果的影响。(3)取第3张多组织芯片行常规Ki-67免疫组化染色(常规脱蜡至水；pH 9.0修复液高压修复，喷气后计时2 min；3%过氧化氢封闭10 min；Ki-67一抗工作液室温孵育60 min；Reaction Buffer冲洗；EnVision二抗室温孵育30 min；Reaction Buffer冲洗；DAB显色，室温孵育10 min；蒸馏水冲洗；复染，封片)。第4张常规脱蜡、修复、10%过氧化氢封闭后，使用10%氨水乙醇溶液浸泡封闭20 min后，流水冲洗5 min，然后按常规流程行Ki-67免疫组化染色。第5张按第3张多组织芯片行常规Ki-67免疫组化染色完成后，脱水透明封片前，使用10%氨水乙醇溶液室温浸泡封闭20 min后，流水冲洗5 min，进行后续脱水透明与封片，明确10%氨水乙醇溶液脱福尔马林色素操作对免疫组化染色的影响。通过上述10%氨水乙醇溶液脱福尔马林色素前后HE和免疫组化染色的比较，明确COVID-19尸检样本中福尔马林色素存在状态和10%氨水乙醇溶液褪色的效果及其对相关染色的影响。

2 结果

2.1 HE染色切片中福尔马林色素的分布心、肝、脾、肺、肾等组织中均有不同程度的福尔马林色素出现。不同组织中存在的程度不同，差异明显；按照色素多少排序，脾脏>肾脏>肺脏>脑>肝脏。其中脾脏在细胞间质和脾脏细胞中广泛存在；肾脏中近曲小管、远曲小管和肾小球的细胞质中均存在(图1)；肺脏中的福尔马林色素出现在血管上皮胞质和红细胞表面，少量吞噬细胞中也可查及(图2)。脑组织和肝脏中较少出现。福尔马林色素在HE染色切片中呈现大小不等的棕黑色圆形球状颗粒。

2.2 HE染色切片中福尔马林色素的消除其中1例COVID-19尸检样本的心、肝、脾、肺、肾和非COVID-19子宫肌瘤组织芯片常规脱蜡后使用10%氨水乙醇溶液室温浸泡20 min，水洗5 min后与对照未处理切片一起行HE染色，封片。各组织中所有棕黑色福尔马林色素完全消失(图3、4)，与对照组HE染色差异无显著性。对照组子宫肌瘤组织处理前后HE染色未见明显差异。

2.3 福尔马林色素消除对免疫组化判读的影响Ki-67常规免疫组化染色切片中可见棕褐色、大小不等的圆形球状颗粒，其分布数量和位置与HE染色切片中的分布一致，胞核阳性的Ki-67免疫组化染色切片中可见胞质和胞膜中的福尔马林色素(图5)，除了分布特点不同几乎与DAB显色的颜色和深浅完全一致，难以鉴别。免疫组化反应前和免疫组化反应后分别使用10%氨水乙醇溶液进行脱色素处理福尔马林色素，几乎完全消除(图6)，仅在部分区域可见非常浅的棕色色素残留痕迹，易与DAB显色的色素鉴别。3张组织芯片中各组织中Ki-67的表达未见明显差异。

图1 肾脏HE染色可见肾小球、近曲小管和远曲小管细胞质中存在福尔马林色素颗粒(黄色箭头) 图2 肺脏HE染色可见红细胞表面、血管上皮细胞质和少量吞噬细胞胞质中存在福尔马林色素颗粒(黄色箭头) 图3 肾脏经10%氨水乙醇溶液脱色后进行HE染色、肾小球、近曲小管和远曲小管细胞质中棕黑色福尔马林色素完全消失，HE染色未见明显影响 图4 肺脏HE染色可见红细胞表面、血管上皮细胞质和少量吞噬细胞胞质中福尔马林色素颗粒完全消失，HE染色未见明显影响 图5 脾脏Ki-67免疫组化染色可见除Ki-67胞核阳性，在组织细胞中广泛存在深棕褐色福尔马林色素颗粒(黄色箭头)难以与DAB色素区分 图6 脾脏使用10%氨水乙醇溶液进行脱色，可见福尔马林色素完全消失，Ki-67免疫组化染色结果未受明显影响

3 讨论

10%中性缓冲福尔马林作为标准固定液在临床外科病理诊断工作的样本处理过程中广泛、规范使用，在常规病理诊断工作中已经很难查见福尔马林色素。COVID-19尸检团队首先在COVID-19尸检样本的免疫组化染色切片中发现了定位清晰，分布广泛的圆形棕褐色圆形球状颗粒，尤其是在进行病毒蛋白的染色预实验时，这种颗粒最初甚至被认为是病毒颗粒染色。后来经过仔细阅片，发现HE切片中同样位置有圆形棕黑色球样颗粒存在，怀疑这些色素并非病毒颗粒的阳性染色而是某种假阳性或内源性颗粒。多次实验后逐步排除了这类棕褐色或棕黑色颗粒是内源性地高辛、内源性生物素和内源性过氧化物酶作用结果的可能性。其与老年性脂褐素和肝脏的胆色素在形状、分布和颜色上差异有显著性，易识别，最终我们将目标锁定为“福尔马林色素”[3-5]。

因此，设计了本实验，验证推测并明确脱色处理对于后续HE染色、免疫组化染色的影响。根据文献[2-5]，最初将目标脱色液设定为饱和苦味酸乙醇溶液；实验准备时，发现苦味酸属于危化品，多方求购均未购得。继续检索文献[3,6-8]发现1%NaOH乙醇溶液、1%KOH乙醇溶液、10%氨水乙醇溶液均可作为福尔马林脱色溶液。考虑到NaOH和KOH均为强碱，难以购买，而氨水化学性质较平和、安全、易购，所以选择10%氨水乙醇溶液作为本实验的福尔马林色素脱色溶液。实验结果显示，10%氨水乙醇溶液可以有效去除尸检组织细胞中的棕黑色或棕褐色圆形球状颗粒样色素，这即明确了福尔马林色素的存在，同时也说明该脱色液是有效的；使用该脱色液进行脱色并充分水洗后，进行后续的HE和免疫组化染色，对结果无影响。以Ki-67免疫组化染色为例，于免疫组化反应前或后进行脱色反应，对免疫组化染色结果无影响，但考虑到免疫组化染色过程中众多影响因素的不确定性，笔者建议可以在完成免疫组化的DAB显色后再进行脱色反应，即不会影响免疫组化染色，也不会对DAB染色结果造成影响。10%氨水乙醇脱色液作用时间短，脱福尔马林效果理想，可以作为病理科脱福尔马林色素的首选方法。需要注意的是，10%氨水乙醇脱色液具有较强的刺激性气味，储存液体需使用带盖可密封的塑料瓶室温避光保存，脱色时使用玻璃带盖考普林瓶，操作时人员带手套，口罩，处于上风口，避免吸入刺激性气味。

通常，人们认为组织长期在酸性福尔马林的固定下酸性甲醛作用于组织内血红蛋白形成酸性甲醛正铁血红素复合物，即福尔马林色素[4]。本次尸检样本采用了40%甲醛溶液，进行短时间固定，也出现了福尔马林色素，说明其可能与福尔马林的浓度也有关系。有研究显示，在腐败的尸检组织中福尔马林色素的数量更多，认为组织和细胞在腐败过程中的酸化也会导致福尔马林色素的产生[7]。传统上认为福尔马林色素往往出现在出血较多即血红蛋白丰富的组织和细胞区域，但对本次尸检样本的观察发现，福尔马林色素除了在脾脏组织间质和细胞内广泛存在，在肾脏中主要存在于肾小管和肾小球的细胞质中，那里并没有血红蛋白的大量存在。也未发现广泛出血的肺组织中存在大量的福尔马林色素，而主要聚集于血管基底细胞的胞质中和血管内红细胞的胞膜上，类似黏附存在。这些均说明，福尔马林色素的组成成分可能并非之前认识的那样。此外，很多文献描述福尔马林色素是不定形色素，但本组实验观察发现福尔马林色素颗粒是非常规整的圆形球状颗粒，虽然大小有所差异，但直径比在3倍以内，可以认为其是一种一致性较强的圆形球状结构。最后，关于福尔马林色素的化学性质，通常认为其为酸性化合物，这一点可通过本实验(10%氨水乙醇溶液，碱性)和NaOH、KOH乙醇溶液可有效脱色推断和解释，但饱和苦味酸乙醇溶液也被认为是一种有效的脱色液，苦味酸pH值为0.38，是一种强酸，那么苦味酸是如何与福尔马林色素反应使其脱色的？明确福尔马林色素的化学构成，关系到理解福尔马林色素产生的机制及其脱色原理。这提醒病理工作者，对于很多病理现象我们仍然知之甚少，需要继续深入探究。