基于FA修饰的CS@Fe-TiO2复合纳米颗粒体外PDT灭活HL60细胞的试验研究

刘丽玲，赵 杨，张启云，方 杰，陈 丽，艾保全，熊建文*

（1. 华南师范大学物理与电信工程学院，广州 510006；2. 广东工业大学物理与光电工程学院，广州 510006）

光动力疗法（photodynamic therapy, PDT）是近年兴起的一种旨在选择性消除癌细胞的非手术方法，因其具有疗效准确、复发率低、创伤性小等优点而成为治疗白血病的新方法［1-2］。PDT具有三大基本要素：光敏剂、光源及组织氧浓度［3］，其中光敏剂是PDT的核心要素，因此研制新型高效的光敏剂就成为一个重要的工作。TiO2纳米颗粒被认为是PDT中的一种潜在光敏剂，但由于纯TiO2具有较宽的带隙（3.2 eV）宽度，使其可见光响应较低，表面生成的电子和空穴复合率高，此外TiO2的热力学性能不稳定导致其易团聚，因而在PDT的临床应用中受到了一定的限制［4］。

为了解决上述难题，国内外诸多研究学者对TiO2进行了改性研究（例如非金属掺杂、金属掺杂、半导体复合、量子点修饰等［5-9］），使其光催化活性得到了显著提高。其中铁的掺杂能很好地改善TiO2的性能，使其在可见光波段的吸收光谱显著红移［10］，但暴露在TiO2表面的金属离子可能会对细胞产生细胞毒性。近来的研究表明，壳聚糖（chitosan，CS）是一种天然、无毒、具有良好生物相容性的氨基多糖，可被不同的水解酶降解。该生物聚合物在生物体抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等方面具有广阔的应用前景［11-12］，其在酸性介质中的聚阳离子性质有利于与多阴离子的物质形成强静电相互作用，能够有效地发挥生物载体的功能［13-14］。

本文选用CS对Fe-TiO2进行包裹，以三聚磷酸钠为聚阴离子模板分子诱导CS形成CS@Fe-TiO2纳米颗粒［12］，将TiO2的吸收光谱拓展至可见光区，使其具有良好的生物相容性。此外，为了增强CS@Fe-TiO2光动力治疗白血病的效果，本研究进一步使用了对癌细胞具有靶向作用的叶酸（folic acid, FA）对其进行修饰，以实现其对癌细胞的特异性结合，从而达到提高PDT灭活HL60细胞的效率。此外，本文将FACS@Fe-TiO2和CS@Fe-TiO2对HL60细胞的灭活效果进行了对比，并深入探究了PDT灭活HL60细胞的作用机理。

1 材料与方法

1.1 试验细胞株

早幼粒细胞白血病的细胞系（HL60）由中山大学动物中心细胞库提供。

1.2 试剂与仪器

钛酸丁酯，硝酸，硝酸铁（FeN3O9·9H2O），三聚磷酸钠，冰乙酸，无水乙醇，FA（C19H19N7O6，≥99.9%），CS（脱乙酰度≥95%），二甲基亚砜［（CH3）2SO］，三乙胺（C6H15N，≥99.5%），N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，C4H5NO3，≥98%），台盼蓝试剂（美国 Invitrogen），CCK-8（cell counting kit-8）试剂（日本同仁化学研究所），四氢呋喃（tetrahydrofuran，THF，天津 致远），活性氧检测试剂（普利莱），RPMI-1604培养基（美国Gibco）。

扫描电子显微镜（scanning electron microscope,SEM），X射线粉末演示仪（德国 Bruker），傅里叶红外光谱仪（Nicolet6700，美国 热电尼高力），UV-1700紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu），WFY-28型荧光分光光度计（天津 拓普），超微振荡器（姜堰 新康），SK2510LHC超声仪（上海 科导），磁力加热搅拌器（江苏 科析），酶标仪（美国 Bio Rad），CountessTM型自动细胞计数仪（美国 Invitrogen），PDT反应室（自行设计），SW-CJ型洁净工作台（苏州 安泰），HH·CP-TW（80 L）二氧化碳培养箱（上海 一恒科技），干燥箱，96孔板及细胞计数板等其他常规器皿。

1.3 试验方法

1.3.1 制备复合纳米颗粒FA-CS@Fe-TiO2

Fe-TiO2的制备：室温下，将20 mL钛酸丁酯与10 mL无水乙醇混合，磁力搅拌30 min后得到A溶液；称取质量为0.458 g的硝酸铁（FeN3O9·9H2O）加入到无水乙醇中，超声分散至完全溶解得到B溶液；在磁力搅拌的状态下将B溶液缓慢加入A中，并用适当的硝酸调节溶液的pH，继续搅拌1.5 h直至形成均匀透明的溶胶；溶胶经陈化、干燥和热处理得到掺铁量为2%的Fe-TiO2。用同样的方法制得纯的TiO2。

CS@Fe-TiO2的制备 ：取0.100 g的三聚磷酸钠溶于10 mL的去离子水中，磁力搅拌30 min后得A液；取0.250 g的CS溶于10 mL的冰乙酸中，磁力搅拌2.0 h 后得 B液 ；取0.500 g的 Fe-TiO2超声分散于10 mL的无水乙醇中直至完全溶解得C液；先将A液缓慢滴入B液中，随后将C液缓慢滴入并不断搅拌得混合液D；室温下磁力搅拌3.0 h完成官能化后用去离子水清洗3次，离心后于80℃下真空干燥，所得纳米颗粒命名为CS@Fe-TiO2（1:1）。用同样的方法制得CS@Fe-TiO2（3:2）和 CS@Fe-TiO2（2:1）。

FA的活化及对CS@Fe-TiO2的修饰：称0.500 g的CS@Fe-TiO2（1:1）于10 mL的冰乙酸中充分溶解得I液 ；取0.180 g三乙胺和0.500 g FA加入到20 mL的二甲基亚砜中，磁力搅拌2.0 h后，称取0.260 g羟基琥珀酰亚胺、0.470 g二环已基碳二亚胺加入到上述混合溶液中，黑暗条件下反应12.0 h后过滤，在滤液中缓慢加入I液，常温下搅拌12.0 h后离心、干燥、研磨，所制备的纳米颗粒命名为FA-CS@Fe-TiO2（1:1）。用同样的方法制得FA-CS@Fe-TiO2（3:2）和FA-CS@Fe-TiO2（2:1）。

1.3.2 FA-CS@Fe-TiO2复合纳米颗粒的表征手段

用扫描电子显微镜对CS@Fe-TiO2复合纳米颗粒进行成像分析，检测样品的分散性；用傅里叶红外光谱（Fourier transformation infrared spectrum, FTIR）仪测量颗粒的成分 ；用X射线衍射（X-ray diffraction, XRD）仪检测样品的衍射峰，并根据衍射图谱检测样品的组成 ；用荧光光谱（ fl uorescence spectre, FS）分析其激发、发射光谱范围和强度等。

1.3.3 HL60细胞的培养与计数

将HL60细胞接种于完全RPMI-1640培养基中，再把整个培养基放入37℃、5%CO2、95%空气湿度的二氧化碳培养箱中培养。培养适当时间后换液打散至细胞液均匀，取此细胞液与台盼蓝按1:1的体积比混合并迅速滴至细胞计数板上，随后将细胞计数板插入CountessTM型自动细胞计数仪中计数。细胞数量满足试验要求后，取此处于对数生长期的细胞进行试验。

1.3.4 FA-CS@Fe-TiO2复合纳米颗粒对HL60细胞的暗毒性试验及PDT试验

根据试验内容规划96孔培养板，分为非光照组和光照组。非光照组包括遮光板（A板、C板），光照组包括光照板（B板、D板），每个板均设置对照组和试验组。为了减少试验误差，同一条件下均设置3个重复孔。取对数生长期浓度为3.5×105个/mL的HL60细胞接种到已规划好的96孔板中，对照组和试验组每孔均接种100 μL的细胞液；接着在试验组中加入终值质量浓度分别为5、10、20、40、80、160 μg/mL的TiO2、Fe-TiO2、CS、CS@Fe-TiO2、FA-CS@Fe-TiO2溶液各100 μL，而对照组中每孔各加入100 μL血清含量为10%的RPMI-1640培养液，随后把96孔板放到微量震荡仪中震荡3 min，再用无水乙醇擦拭96孔板消毒后置于培养箱中培养。其中，光照板（B、D板）培养12.0 h后置入波长为 410 nm、光功率为5 mW/cm2的光动力辐照室中光照1.0 h再继续培养；而遮光板（A、C板）则连续避光培养12.0 h。然后每孔均加入20 μL的CCK-8试剂［15］，震荡均匀后用无水乙醇擦拭消毒，置入培养箱中再培养3.0 h。使用酶标仪对上述的试验组和对照组进行细胞活性的吸光度检测，设定450 nm为测量波长，630 nm为参比波长。

1.3.5 数据处理与分析

试验数据主要采用Origin8、Mathtype、SPSS11.5软件进行处理，结果用均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 复合纳米颗粒FA-CS@Fe-TiO2的表征

2.1.1 SEM成像分析

图1 TiO2、Fe-TiO2、CS@Fe-TiO2纳米颗粒的SEM图Fig. 1 SEM images of TiO2, Fe-TiO2, CS@Fe-TiO2 nanoparticles（a）TiO2纳米颗粒SEM图 ；（b）Fe-TiO2纳米颗粒SEM图 ；（c）CS@Fe-TiO2纳米颗粒SEM图。(a) SEM image of TiO2 nanoparticles； (b) SEM image of Fe-TiO2 nanoparticles； (c) SEM image of CS@Fe-TiO2 nanoparticles.

采用扫描电子显微镜对样品的表面形貌进行观察。如图1所示分别为TiO2、Fe-TiO2和CS@Fe-TiO2纳米颗粒的SEM图像。由图1a、1b可知，Fe的掺杂可以很好地改善TiO2的团聚现象，但Fe掺杂后的纳米颗粒较大。而由图1c可知，经CS的包裹后，纳米颗粒的外观形貌发生了改变，在更高的放大倍率下，可见纳米化的CS@Fe-TiO2结构致密，成椭球形或扁球形颗粒，虽然存在少数小的聚集体，但其粒径大约在30～50 nm之间，细胞仍能摄取［9，13］。

2.1.2 XRD分析

如图2所示，由曲线a可知，在2θ为25.38°、37.85°、48.13°、53.96°、55.18°、62.79°、68.86°、75.40°等处出现了分别对应锐钛矿（101）、（004）、（200）、（105）、（211）、（204）、（116）、（215）晶面的衍射峰；由曲线f可知，在2θ=10.62°、19.88°处出现了纯CS的2个主要特征峰，在29.60°、35.88°和40.10°附近呈现出小的额外峰值，这种类似的结果与Zhu等［16］的研究结果一致。此外可看出，曲线c、d、e的衍射峰值除了与TiO2材料的锐钛矿相相关外，在2θ=10.62°处还出现了属于CS的特征峰。因此，XRD结果证实了CS@Fe-TiO2纳米复合材料体系的形成。

图2 TiO2、CS@Fe-TiO2纳米颗粒的X射线衍射谱Fig. 2 XRD patterns of TiO2, CS@Fe-TiO2 nanoparticles

2.1.3 傅里叶红外光谱分析

图3为各纳米颗粒的傅里叶红外光谱图。在图3a中，曲线（1）、（2）均在804.00 cm-1左右出现了Ti-O键相对应的特征峰，但曲线（2）中Ti-O键的伸缩振动峰明显减弱，说明Fe已取代Ti成功地掺入TiO2内部。曲线（3）为纯CS的光谱图，在1 592.32 cm-1处出现的吸收峰为氨基的振动峰，在1 061.98 cm-1和1 150.79 cm-1处分别出现了归因于N-H的伸缩振动峰和-OH的伸缩振动峰，并且在3 360.95 cm-1和2 871.75 cm-1处出现了属于羟基和C-H基团的振动峰［17-18］。通过对曲线（4）的红外光谱分析可知，复合纳米颗粒中的C-O、氨基和羟基的伸缩振动与CS的官能团一致，表明CS生物大分子包裹了纳米颗粒Fe-TiO2［19］。

如图3b所示，曲线（1）在2 925.00～3 545.00 cm-1处出现的吸收峰，表示FA中出现了蝶呤环的-NH....H伸缩振动峰以及谷氨酸的-OH伸缩振动峰。在1 694.00 cm-1和 1 640.00 cm-1处出现了归因于谷氨酸中-COOH基团的C=O和-CO-NH-中C=O的伸缩振动峰。此外，在1 485.00 cm-1与 1 414.00 cm-1处还显示出苯环的伸缩振动峰和苯酚-OH的振动吸收峰［20］。曲线（2）是NHS-FA的红外光谱图，在1 201.00 cm-1和1 068.00 cm-1处出现的吸收峰值代表C-O和N-O的伸缩振动峰。而在1 729.00 cm-1处出现了新的振动吸收峰，其原因为羟基琥珀酰亚胺中苯环上的-OH的分裂并与FA的C=O连接形成了琥珀酰亚胺酯。对比曲线（2）、（3）、（4）可知，NHS-FA与CS@Fe-TiO2在1 400.00 cm-1处均出现了表示-C-O的特征峰。值得注意的是NHS-FA在1 206.34 cm-1的吸收峰即NHS酯上的羰基峰，在修饰后的纳米颗粒FA-CS@Fe-TiO2上消失了，说明FA活性酯有了明显的变化。而FA-CS@Fe-TiO2的图谱中出现了FA的δC-H特征峰和酰胺键υC=O特征峰，说明FA与CS@Fe-TiO2已成功连接上。

2.1.4 紫外-可见光（UV-Vis）吸收光谱和光源分析

通过测试得TiO2、Fe-TiO2和CS@Fe-TiO2的紫外-可见吸收光谱（ultraviolet and visible spectroscopy, UVVis）如图4a所示，TiO2的吸收光谱主要位于390 nm以下且吸收峰不强，但经过Fe与CS的掺杂后，可以看出CS@Fe-TiO2在410～420 nm UV-Vis范围内吸收明显增强，说明TiO2的团聚会影响其对光的吸收，而Fe、CS的掺杂能有效提高TiO2在紫外-可见光照下的光催化活性，且随着CS含量的增加，吸收光谱发生红移的现象越来越明显。图4b是本实验室所使用的光动力试验光源（light emitting diode, LED）的发射光谱，其发射峰为410.17 nm，满足可见光激发此纳米材料的条件，能有效发生光催化反应。

2.2 复合纳米颗粒对HL60细胞的暗毒性试验

图3 不同纳米颗粒的傅里叶红外光谱Fig. 3 FTIR of different nanoparticles（a）TiO2、Fe-TiO2、CS、CS@Fe-TiO2 纳米颗粒的FTIR图 ；（b）CS@Fe-TiO2、FA、NHS-FA、FA-CS@Fe-TiO2纳米颗粒的FTIR图。(a) FTIR of TiO2, Fe-TiO2, CS, CS@Fe-TiO2 nanoparticles； (b) FTIR of CS@Fe-TiO2, FA, NHS-FA, FA-CS@Fe-TiO2 nanoparticles.

图4 纳米颗粒的UV-vis吸收光谱与光动力试验箱LED阵列的发射光谱Fig. 4 UV-vis spectrum of nanoparticles and emission spectrum of LED arrays of PDT irradiation chamber（a）纳米颗粒的UV-vis吸收光谱；（b）光动力试验箱LED阵列的发射光谱。(a) UV-vis spectrum of nanoparticles； (b) Emission spectrum of LED arrays of PDT irradiation chamber.

图5分别为非光照条件下TiO2、Fe-TiO2、CS以及不同质量比的CS@Fe-TiO2和FA-CS@Fe-TiO2复合纳米颗粒对HL60细胞相对存活率的影响。结果表明，CS本身对细胞的生长无明显抑制作用，且在低质量浓度5 μg/mL时对细胞生长还有一定的促进作用；而随着 TiO2、Fe-TiO2、CS@Fe-TiO2、FA-CS@Fe-TiO2离子质量浓度的升高，细胞的相对存活率逐渐降低，即各纳米材料对细胞的暗毒性随其质量浓度的升高逐渐增强。但相对于Fe-TiO2和FA-CS@Fe-TiO2的暗毒性，CS@Fe-TiO2的暗毒性降低更明显，细胞的相对存活率整体偏高，即使在160 μg/mL的高质量浓度作用下，与CS@Fe-TiO2（3:2）共孵育的HL60细胞其相对存活率仍可高达85%，另外CS@Fe-TiO2（1:1）和CS@Fe-TiO2（2:1）的相对存活率分别为80%、83%，这表明CS的包裹能改善金属Fe掺杂带来的毒副作用，从而显著提高复合纳米颗粒的生物相容性。

2.3 复合纳米颗粒对HL60细胞的PDT体外灭活试验

PDT效率的计算公式：

式中EfficiencyPDT为PDT效率；ODirradiation为光照组的OD值；ODwithout-irradiation为遮光组的OD值。

图5 暗室条件下经不同纳米颗粒作用后HL60细胞的相对存活率Fig. 5 Relative survival rate of HL60 cells in dark room after different nanoparticles（a）不同质量浓度TiO2、Fe-TiO2、CS对HL60细胞的暗毒性分析（P＜0.05）；（b）不同质量浓度CS@Fe-TiO2对HL60细胞的暗毒性分析（P＜0.05）；（c）不同质量浓度FA-CS@Fe-TiO2对HL60细胞的暗毒性分析（P＜0.05）。(a) Dark toxicity analysis of different mass concentrations of TiO2, Fe-TiO2, CS on HL60 cells (P＜0.05)； (b) Dark toxicity analysis of different mass concentrations of CS@Fe-TiO2 on HL60 cells (P＜0.05)； (c) Dark toxicity analysis of different mass concentrations of FA-CS@Fe-TiO2 on HL60 cells (P＜0.05).

由图5b、5c的暗毒性试验数据可知，HL60细胞与未用FA修饰的CS@Fe-TiO2纳米颗粒和FA修饰后的CS@Fe-TiO2纳米颗粒共孵育后，后者细胞的相对存活率较前者细胞的相对存活率降低了7%左右。在光照剂量为18 J/cm2、波长为410 nm的光源下进行PDT之后，HL60细胞的相对存活率明显低于之前的遮光组。如图6a、6b可知，当光照条件一样时，同一质量浓度不同纳米颗粒作用下的HL60细胞的相对存活率依次为：FA-CS@Fe-TiO2（3:2）＜FACS@Fe-TiO2（2:1）＜FA-CS@Fe-TiO2（1:1）＜CS@Fe-TiO2（3:2）＜CS@Fe-TiO2（2:1）＜CS@Fe-TiO2（1:1）＜Fe-TiO2＜TiO2，且FA-CS@Fe-TiO2作用后的细胞相对存活率较CS@Fe-TiO2作用后的细胞相对存活率降低了19%左右。由此可知FA-CS@Fe-TiO2纳米颗粒的暗毒性和光催化过程均能杀伤灭活HL60细胞，而在PDT试验中FA-CS@Fe-TiO2的靶向光催化灭活占主要地位。由图6c可知，随着各纳米颗粒质量浓度的升高，其PDT灭活HL60细胞的效率逐渐增强，并且经过Fe掺杂、CS包裹的复合纳米颗粒的PDT效率均不同程度地高于纯TiO2，说明Fe的掺杂以及CS的包裹可以不同程度地提高TiO2的光催化活性，从而提高PDT的灭活效率。另外在质量浓度大于80 μg/mL后，PDT效率的上升趋势变缓，这可能是由于纳米颗粒的质量浓度偏高，HL60细胞对纳米颗粒的吸收已达到饱和，影响了细胞的摄取。此外还可看出，CS@Fe-TiO2（3:2）的整体PDT效率要高于另外2种不同比例的CS@Fe-TiO2纳米材料，其PDT效率最高可达55.18%。其原因可能是：适量的CS包裹有利于提高复合纳米颗粒的光催化活性；少量的CS包裹使得复合纳米颗粒所含氨基、羟基的数量有限，因而光催化效果不佳；而过量的CS会导致复合纳米颗粒的凝聚，从而影响其分散性，使得光照射到的面积有限。

由图6d可知，FA-CS@Fe-TiO2的PDT灭活效率要远高于TiO2的PDT灭活效率，且随着粒子质量浓度的升高，FA-CS@Fe-TiO2的PDT灭活效率也逐渐增强。当质量浓度为160 μg/mL时，FA-CS@Fe-TiO2（3:2）纳米颗粒的PDT灭活效率达到78.75%，比同质量浓度未用FA修饰的CS@Fe-TiO2（3:2）增加了23.57%，说明FA的修饰能使复合纳米颗粒对HL60细胞具有良好的靶向性，能增强其灭活效果。

图6 不同质量浓度纳米颗粒对HL60细胞的活性影响以及PDT灭活效率Fig. 6 Effect of nanoparticles of different concentrations on HL60 cell activity and PDT inactivation efficiency（a）不同质量浓度TiO2、Fe-TiO2、CS@Fe-TiO2处理的HL60细胞在光照下的细胞存活率（P＜0.05）；（b）不同质量浓度TiO2、FA-CS@Fe-TiO2处理的HL60细胞在光照下的细胞存活率（P＜0.05）；（c）不同质量浓度TiO2、Fe-TiO2、CS@Fe-TiO2对HL60细胞的PDT灭活效率（P＜0.05）；（d）不同质量浓度TiO2、FA-CS@Fe-TiO2对HL60细胞的PDT灭活效率（P＜0.05）。(a) Cell survival rate of HL60 cells treated with different mass concentrations of TiO2, Fe-TiO2, CS@Fe-TiO2 under light (P＜0.05)； (b) Cell survival rate of HL60 cells treated with different mass concentrations of TiO2, FA-CS@Fe-TiO2 under light (P＜0.05)； (c) PDT ef ficiency of HL60 cells with different mass concentrations of TiO2, Fe-TiO2, CS@Fe-TiO2 (P＜0.05)； (d) PDT ef ficiency of HL60 cells with different mass concentrations of TiO2, FA-CS@Fe-TiO2 (P＜0.05).

2.4 FA-CS@Fe-TiO2纳米颗粒PDT体外灭活HL60细胞的机理分析

2.4.1 FS分析

本试验进一步测试了TiO2、Fe-TiO2和不同质量比的CS@Fe-TiO2纳米颗粒的荧光发射光谱，试验结果如图7所示。从图7中可知，TiO2在掺杂Fe、CS之后，其荧光强度出现了明显的变化。对比单纯的TiO2，Fe-TiO2及不同比例的CS@Fe-TiO2的荧光发射强度均有不同程度的降低，且CS@Fe-TiO2（3:2）的荧光强度最低。相关研究表明，半导体颗粒的光致发射光谱是由其内部电子-空穴的复合所引起的，其荧光强弱的变化与在适当波长激发下的颗粒内部载流子电荷的转化、迁移和捕获效率相一致，电子-空穴复合率越高则荧光强度越强［21-22］。由此可知，410 nm光照下，Fe、CS与TiO2之间发生了有效的电子转移，使其空穴电子的复合率明显降低。其中CS@Fe-TiO2（3:2）的荧光强度减弱程度最大，表明电子-空穴的复合率越低，可参与吸收转移光子能量的粒子越多、光催化效果越好。

图7 不同纳米颗粒的荧光发射光谱（λex = 410 nm）Fig. 7 Fluorescence emission spectra of different nanoparticles(λex = 410 nm)

2.4.2 FA-CS@Fe-TiO2复合纳米颗粒介导的PDT试验过程中活性氧（ROS）的检测

在PDT中，活性氧（reactive oxygen species, ROS）是造成细胞损伤、诱导细胞凋亡的主要媒介［23］，因此光照后在细胞内部导致的ROS产量已经成为评价光敏剂性能的一个重要指标。图8为TiO2、Fe-TiO2、CS@Fe-TiO2和FA-CS@Fe-TiO2介导的PDT过程中细胞内ROS的荧光光谱图。从图8中可得，ROS（TiO2）＜ROS（Fe-TiO2）＜ROS（CS@Fe-TiO2）＜ROS（FA-CS@Fe-TiO2），显然掺杂后的TiO2能产生更多的ROS。分析可知，当光辐射到复合纳米颗粒表面时，其价带电子吸收光子的能量跃迁到导带，因而在价带中产生空穴。导带电子和价带空穴与细胞内的氧分子、水分子分别发生氧化和还原反应，而两者均能产生大量的活性氧物质，如超氧阴离子自由基（O2·-）、羟基自由基（OH·）等。通过Fe、CS掺杂后，复合纳米颗粒中氨基、羟基有效地抑制了其电子-空穴的复合，促进了光催化过程中的氧化还原反应，因而产生了更多的活性氧物质。其氧化反应方程式如下：

此外，经FA修饰后，复合纳米颗粒对HL60细胞具有靶向性，因而进入细胞内参与光动力反应的纳米颗粒不断增多，PDT过程中介导产生的ROS含量也不断增加。

图8 PDT作用后HL60细胞中ROS探针的荧光光谱（λex = 485 nm）Fig. 8 Fluorescence spectra of ROS probe in HL60 cells after PDT for 485 nm

2.4.3 细胞内摄取纳米颗粒的荧光强度分析

如图9所示，曲线（1）表示细胞内CS@Fe-TiO2所产生的荧光强度，曲线（2）表示细胞内FA-CS@Fe-TiO2所产生的荧光强度。与CS@Fe-TiO2相比，FACS@Fe-TiO2的荧光强度显著增强，即表明被细胞摄取参与到细胞活化反应的FA-CS@Fe-TiO2纳米颗粒远远多于CS@Fe-TiO2，说明了FA的修饰可以增强纳米颗粒的靶向性，显著提高细胞对复合纳米颗粒的摄取效率，从而提高PDT灭活效率，因此起到了较好的修饰效果。这与前面FA-CS@Fe-TiO2的PDT效率高于CS@Fe-TiO2的PDT效率相一致。

图9 细胞摄取不同纳米颗粒的荧光光谱Fig. 9 Fluorescence spectrum of cells taking up different nanoparticles

3 讨论

本文主要研究了TiO2改性后形成的复合纳米颗粒FA-CS@Fe-TiO2对HL60细胞的PDT灭活作用。采用溶胶凝胶法、离子交联法、表面修饰等方法制备了FA-CS@Fe-TiO2复合纳米颗粒。SEM图像表明Fe的掺杂能有效提高纳米颗粒的分散性。紫外-可见光谱表明，Fe掺杂后纳米颗粒的吸收边明显红移。通过傅里叶红外光谱图对不同纳米颗粒所含基团的振动吸收峰进行对比可知，FA与CS@Fe-TiO2已连接成功，使得复合纳米颗粒对HL60细胞具有良好的靶向性，有效地提高了FA-CS@Fe-TiO2的PDT体外灭活HL60细胞的效率。细胞试验表明，暗室条件下TiO2、Fe-TiO2均有较低的毒性，而低质量浓度的CS能促进HL60细胞的生长，可能是因为低质量浓度的CS能够在生物体内降解。此外Fe-TiO2被CS包裹后也具有较好的生物相容性。在PDT中，当光照射光敏剂时，光敏剂能吸收光子的能量从基态跃迁到激发态，随后将吸收的能量转移到附近的氧气分子上产生单线态氧，或者与周围的物质通过电子转移发生光化学反应产生活性氧物质［24-25］。活性氧物质能与细胞生物膜、各种亚细胞器以及细胞内大分子（例如蛋白质、核酸等）发生反应，加快机体衰老，诱导细胞坏死或凋亡。本文的PDT试验结果显示，FA-CS@Fe-TiO2整体的PDT灭活效率远远高于TiO2、CS@Fe-TiO2，且随着纳米粒子质量浓度的升高，FA-CS@Fe-TiO2的PDT灭活效率也逐渐增强。当质量浓度为160 μg/mL时，FA-CS@Fe-TiO2（3:2）纳米颗粒的PDT灭活效率达到78.75%，比同质量浓度未用FA修饰的CS@Fe-TiO2（3:2）增加了23.57%，比同质量浓度的TiO2增加了54.75%。分析其原因可知：Fe和CS的掺杂能有效地抑制TiO2中电子和空穴的复合，从而提高复合纳米颗粒的光催化活性，在PDT过程中产生更多的活性氧物质。而FA的修饰增强了复合纳米颗粒与HL60细胞的特异性结合，进一步提高了FA-CS@Fe-TiO2对HL60细胞的灭活效率。因此，FA-CS@Fe-TiO2有望成为一种用于靶向治疗肿瘤细胞的新型光敏剂。