不同免疫方式对鸡群抗体消长规律的影响

王雪敏，李明珠，李佳佳，薛晓阳，周守长（河北邯郸华裕农业科技有限公司 057150）

1 实验目的

对不同两个场区， 分别用两种方法进行同一种疫苗免疫，通过HI 抗体检测，评价免疫方法。

2 实验材料及鸡群

试验鸡群，某种鸡场A301 批次，420 日龄；某种鸡场B301批次，415 日龄。 免疫疫苗，T3 新支二联活疫苗 （VGGA+ma5+QX）。

3 实验分组

3.1 试验分组

试验组一（A 场）：某种鸡场A301 批次中固定30 只鸡，用T3 新支二联活疫苗（VGGA+ma5+QX)进行点眼免疫，免疫剂量为1 羽份，另固定饮水免疫的30 只鸡作为试验对比对象，免疫剂量为2 羽份。

试验组二 （B 场）： 某种鸡场B301 批次中固定30 只鸡，用T3 新支二联活疫苗（VGGA+ma5+Q)进行点眼免疫，免疫剂量为1 羽份，另固定饮水免疫的30 只鸡作为试验对比对象，免疫剂量为2 羽份。

3.2 检测时间

分别在免疫前1d、免疫后16d、免疫后30d 检测进行采样，采样鸡只包括固定的30 只点眼鸡只，以及固定的饮水免疫的30只鸡，通过HI 抗体检测。

4 检测方法

4.1 物品准备

一次性96 孔V 型反应板，移液器（配有一次性枪头；待检血清； 试验抗原； 生理盐水； 公鸡红细胞；100μL 单道移液器；100μL 八道移液器； 一次性移液器吸头；9cm 直径玻璃平皿；一次性96 孔v 型板；微量振荡器；离心机；10mL 离心管；一次性手套、一次性口罩、记号笔等材料。 ）

4.2 抗凝剂、1%鸡红细胞配比

采血：5mL 注射器吸取1mL 配置好浓度为3.8%的柠檬酸钠抗凝剂，采用翼根静脉方法进行采血。

红细胞的洗涤：将采集好的抗凝血注射到10mL 离心管中，向离心管中加满生理盐水并混匀， 放入离心机内配平，3000rpm离心3min 后，弃掉上清，重复清洗3 次，离心后得到的红细胞沉淀加入生理盐水后放置4℃冷藏备用。

抽出所需的生理盐水， 并从中抽出弃去红细胞所占量，即红细胞与生理盐水比例为1∶100，用移液器插入含有红细胞离心管的底部进行抽取红细胞，加入生理盐水，反复吹吸混匀备用。

4.3 实验操作细则

4.3.1 血液凝集（HA）试验采用96 孔板微量法操作。

4.3.1.1 在微量反应板上， 从第1 孔加生理盐水， 依次加到12 孔，每孔分别加入生理盐水0.025mL。

4.3.1.2 在第1 孔按照生理盐水与抗原1∶1 的比例加入25μL 的抗原，充分震荡成均匀的混悬液。

4.3.1.3 第一孔混悬液震荡均匀后， 从第1 孔吸取25μL 混悬液加入到第12 孔，依次倍比倍稀释至11 孔，再从第11 孔吸出25μL 悬液连同枪头一起丢弃。

4.3.1.4 体积分数为1%鸡红细胞悬液， 每孔依次加入25μL充分震荡混匀。

4.3.1.5 振荡混匀后，在25℃的室温下静置20min 后观察其结果，阳性对照孔的红细胞完全凝集。

4.3.1.6 结果判定： 微量板静置20min 后，2min 内读取血液凝集结果， 红细胞凝集抑制呈现明显的泪滴流淌状。 完全血凝（不流淌）的抗原最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。

4.3.2 血凝抑制（HI）试验（微量法）

4.3.2.1 根据1 试验结果配制4HAU 的病毒抗原。 以完全血凝的抗原最高稀释倍数作为一个抗原的效价， 稀释倍数除以4即为含4HAU 的抗原的稀释倍数。 例如：如果血凝的终点滴度为1∶256，则4HAU 抗原的稀释倍数应是1∶64（256 除以4）。

4.3.2.2 在一次性板的1～12 孔加入25μL 的生理盐水。

4.3.2.3 抽取25 微升血清加入第1 孔内， 充分混匀后吸取25μL 于第2 孔，依次对倍稀释至11 孔，从第11 孔吸取25μL 弃去。

4.3.2.4 1～11 孔均加入含4HAU 混匀的抗原液25μL， 振荡混匀，室温（约20℃～25℃）静置25min。

4.3.2.5 每孔加入25μL 体积分数为1%的鸡红细胞悬液，振荡混匀，室温（约20℃～25℃）静置25min，对照孔红细胞将呈明显纽扣状沉于孔底。

4.3.2.6 结果判定

以完全抑制4 个抗原的血清最高稀释倍数作为HI 滴度。

附录HA 和HI 试验用溶液的配制

1%鸡红细胞悬液制备：

采集至少3 只无免疫的健康公鸡的血液与抗凝剂4∶1 混合，用生理盐水洗涤3 次左右，前两次用2000r/min 离心3min，最后一次以2500r/min 离心3min，洗涤后用生理盐水配成体积分数为1%红细胞悬液，4℃保存备用。

5 试验结果

试验结果详见表1。 通过表1 可见：在本次试验中，使用饮水免疫后，ND 抗体水平未有明显变化， 抗体离散度从数值上看有下降趋势，但从抗体滴度跨度看，没有显著影响。 使用点眼免疫后，ND 抗体均呈现小幅度升高趋势， 且离散度得到较好的改变。

表1 不同免疫方式抗体效果规律

6 结果分析

6.1 当ND 抗体水平在8～9 时，不管采取饮水免疫或点眼免疫，均不能使抗体水平获得较大幅度的提高。

6.2 从抗体上升幅度以及离散度改善程度看，本次饮水免疫均未起到明显的效果，可认为是免疫失败。 而点眼免疫在改善离散度方面起到较好的作用。

6.3 本次饮水免疫的失败，可能由以下两方面导致：当前的规模和设备不适合使用饮水免疫的方法。 饮水免疫操作失败。

6.4 在当前规模养殖条件下， 饮水免疫存在较大的不确定性，如何提高饮水免疫效果，需要探讨。