补阳还五汤预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠抗氧化功能的影响❋

宋忠阳，陈玉婵，雍文兴，张志明△，刘永琦，张利英，张卫强

(1. 甘肃中医药大学中医临床学院，兰州 730000； 2. 甘肃中医药大学定西校区，甘肃 定西 743000；3. 甘肃中医药大学附属医院，兰州 730000； 4. 甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室，兰州 730000)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是全球范围内高发的重大心血管疾病之一，具有高死亡率和致残率的特点。近年来，对于AMI的治疗虽取得较大的进展，但其死亡率仍高居不下，究其原因主要是现代医学发展中出现的以溶栓、急诊经皮冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention，PCI)为代表的治疗方法，虽然能开通闭塞血管，挽救濒死心肌，但在减少急性心肌梗死面积的同时，由于冠状动脉的骤然开通与血流恢复引发的心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)[1]又成为AMI治疗新的困难与挑战，因此减少MIRI成为AMI治疗的关键。目前中医药防治MIRI已成为AMI治疗及基础研究的新方向。临床研究表明，中医药对于MIRI的防治具有疗效稳定、副作用少等优势[2]。补阳还五汤出自清代名医王清任的《医林改错》，该方的主要作用是益气补血、活血化瘀、疏通心脉。大量临床研究证实[3-4]，补阳还五汤对于诸多心血管疾病如心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤、心绞痛、心力衰竭、心律失常等有较好的疗效，能够有效改善MIRI患者的心功能，降低患者血清炎症细胞因子水平。现代研究发现，该方能够清除氧自由基，抑制钙超载，改善血管微循环[5]。

鉴于此，本研究拟运用补阳还五汤预处理，采用结扎冠状动脉左前降支(LAD)的方法建立MIRI大鼠模型，观察补阳还五汤对大鼠血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、血清超氧化物歧化酶(SOD) 及一氧化氮(NO)含量的影响，从实验角度探讨补阳还五汤对MIRI心肌的保护作用，为进一步揭示和研究补阳还五汤治疗心血管疾病的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物

取健康清洁级成年Wistar大鼠40只，雌雄各半，7～8周龄，体质量(240±20)g，均由甘肃中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(甘)2015-0002。大鼠饲养于甘肃中医药大学实验中心SPF级实验室，标准颗粒饲料及洁净饮用水喂养，饲养环境为昼夜各半交替，温度19 ℃～24 ℃，通风良好，湿度恒定。本实验已通过甘肃中医药大学实验动物伦理委员会审批(伦理审批号IACUC2016-039)。

1.2 药品

补阳还五汤根据《医林改错》所载原方的药味配药，剂量每钱以3 g换算。具体药量：生黄芪120 g(购于陇西保和堂药业有限责任公司，生产批号20190802)、当归尾6 g(购于陇西保和堂药业有限责任公司，生产批号20191106)、赤芍4.5 g(购于陇西县徵鑫药业有限责任公司，生产批号1903005)、地龙3 g(购于甘肃中天药业有限责任公司，生产批号20003080)、桃仁3 g(购于甘肃弘润药业有限公司，生产批号20200301)、红花3 g(购于甘肃神农文峰药业有限公司，生产批号20190801)、川芎3 g(购于四川新荷花中药饮片股份有限公司，生产批号D2006005)，经过煎煮浓缩后药物浓度为3 g/ml，放置于4 ℃冰箱贮存备用。以上药物均由甘肃中医药大学附属医院中药制剂室加工提供。

1.3 仪器设备及试剂盒

HX-100E型小动物呼吸机，成都泰盟科技有限公司；Powerlab数据采集分析系统，埃德仪器国际贸易有限公司；7020型全自动生化仪，日本日立公司；VE1OCITY 18R型低温高速离心机，DYNAMICA公司；UTL1386-3-U43型低温冰箱，Thermo Scientific公司；TN-100B型托盘天平，上海第二天平仪器厂；UV-3000型紫外可见分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司；LDH、CK、MDA、SOD、NO试剂盒均购自江苏酶免实业有限公司(Jiangsu Meimian industrial Co., Ltd)，产品批号1809R。

1.4 方法

1.4.1 分组及干预 40只Wistar大鼠随机分为4组各10只。Sham组LAD只穿线不结扎； MIRI组LAD结扎30 min，复灌120 min；缺血预适应组LAD结扎10 min，复灌10 min，反复3次，然后结扎30 min，复灌120 min；补阳还五汤组LAD结扎30 min，复灌120 min； 其中剂量参照《药理实验方法学》[6]中人鼠等效剂量换算，按人体体表面积的0.018倍计算得出。补阳还五汤组给予15 g·kg-1· d-1的药物灌胃，Sham组、MIRI组、缺血预适应组给予等量生理盐水灌胃，各组均以每日1次灌胃，连续7 d。

1.4.2 造模 课题组前期已进行大鼠MIRI模型的改进[7]，具体过程如下：大鼠术前禁食不禁水12 h，称重标记。10%的水合氯醛(0.3 mL·100 g-1) 腹腔麻醉后，仰卧位固定于手术台上，颈部、胸前手术备皮，碘伏消毒，铺无菌孔巾。连接Powerlab数据采集分析系统，记录标准Ⅱ导联心电图，有异常者剔除。切开颈部气管接人工呼吸机进行辅助呼吸(潮气量5 mL/100 g，频率60～80次/min，呼吸比为2∶1，给予呼气末持续正压呼吸)。胸骨左侧0.5 cm 处以第3、4肋骨作为上下边界纵行剪开皮肤约3 cm，用镊子及手术刀钝性分离皮下组织、胸大肌直至肋间肌，用弯止血钳将皮肤和肌肉夹起固定于两侧，于心肌搏动明显处纵行剪开3/4肋骨，用撑开器撑开胸腔，用眼科镊夹破心包膜暴露心脏，在左心耳下缘与肺动脉圆锥间找到左冠状静脉主干，LAD与之伴行，在棉签的协助下挤出心脏，用眼科缝合线在左心耳下缘与肺动脉圆锥间距主动脉根部约2 mm处进针,进针宽度及深度均在2 mm左右，穿线后于左冠状静脉主干上置一自制小塑料管(管中间剪一小孔，方便固定)结扎。结扎成功后肉眼见左心室前壁变青紫或苍白，搏动减弱，心电图示ST段抬高(≥0. 25 mV)为心肌缺血标志。结扎30 min 后用剪刀将结扎线剪断形成再灌注，心电图显示ST段逐渐下降50%左右。造模结束后，按层次依次缝合胸腔、肌肉、皮肤，碘伏消毒，术后腹腔注射少量青霉素预防感染。

1.4.3 观察指标 心电图(ECG)ST段的变化：通过记录大鼠ECG在结扎30 min内和再灌注120 min内的ST段变化情况，观察补阳还五汤对MIRI模型大鼠心电图ST段的影响。生化指标测定，造模结束后腹主动脉采血4～5 ml，置于高速冷冻离心机(3000 r/min，温度-10 ℃)中离心15 min，取上清液2～3 ml置于EP管中，-20 ℃冰箱冷藏，然后按照试剂盒说明书步骤依次测定血清中LDH、CK、SOD活性和MDA及NO含量。采用ELISA法检测血清LDH和CK的活性，采用硫代巴比妥酸法血清MDA含量，黄嘌呤氧化酶法测定血清 SOD活性及硝酸还原酶法测定血清NO含量。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 补阳还五汤对MIRI模型大鼠心电图(ECG)ST段的影响

2.1.1 模型评价结果 图1示，根据ECG观察，Sham组大鼠在实验过程中ECG无明显波动，MIRI组大鼠在结扎缺血30 min过程中及再灌注120 min内，其心电图Ⅱ导联ST段与Sham组比较均有明显抬高(P<0.05)，表现为明显的缺血状态，说明造模成功。

注：A.结扎前(正常心电图)；B.缺血时段；C.再灌注时段图1 大鼠MIRI不同时段心电图表现比较

2.1.2 MIRI各阶段大鼠心电图ST段变化情况比较及各组典型心电图表现 表1图2示，与Sham组比较，MIRI组、缺血预适应组、补阳还五汤组大鼠在结扎缺血30 min过程中及再灌注120 min内其心电图Ⅱ导联ST段均有明显抬高(P<0.05)；与MIRI组比较，补阳还五汤组、缺血预适应组大鼠ECG在结扎缺血30 min内与MIRI组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但随着再灌注时血流的恢复，即再灌注120 min时间段内，MIRI组、补阳还五汤组和缺血预适应组大鼠ECG 的ST段均下降，以补阳还五汤组和缺血预适应组下降最为明显，差异有统计学意义(P<0.05)。补阳还五汤组与缺血预适应组比较，2组大鼠ECG在整个过程中比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 各组大鼠典型心电图表现

表1 各个阶段MIRI模型大鼠心电图ST段变化比较

2.2 补阳还五汤对MIRI模型大鼠LDH、CK、SOD活性、MDA及NO含量的影响

表2示，与Sham组比较，MIRI组大鼠血清中LDH、CK活性及MDA含量显著升高(P<0.05)，SOD活性、NO含量明显降低(均P<0.05)。与MIRI组比较，补阳还五汤组和缺血预适应组大鼠血清中 LDH、CK活性及MDA含量均明显降低(P<0.05)，血清中SOD活性、NO含量显著升高(均P<0.05)。

表2 再灌注后各组大鼠LDH、CK活性比较

3 讨论

MIRI是AMI治疗的重要环节之一，随着现代医疗技术的进步和发展，溶栓、PCI等治疗技术能有效地开通血管，减少心肌坏死的发生，但血管的骤然开通会引发新的心肌损伤，因此如何在有效应用现代医疗技术的同时，最大程度地减轻所导致的二次创伤问题成为本领域研究的热点。研究表明[8]，中医药在MIRI的防护方面拥有丰富的经验和独特的优势，故探索和挖掘中医方剂在防治MIRI中的作用成为目前血管疾病研究的重要方向。

AMI属于中医学“胸痹”范畴，临床表现以胸痛、胸闷、气短、乏力等症状为主，病位在心脉。早在《素问·痹论篇》载：“心痹者，脉不通。”《重订灵兰要览》：“气血不虚则不滞，既虚则鲜有不滞者，所以作痛。”《金匮要略》：“胸痹而痛，所以然者，责其极虚故也”，说明气虚血瘀、本虚标实是胸痹的基本病机，治疗当以益气活血为主[9]。本研究所选的方剂补阳还五汤出自清·王清任的《医林改错》，是益气活血法的代表方剂。大量临床研究证实，补阳还五汤能治疗诸多心血管疾病，如心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤、心绞痛、心力衰竭、心律失常等，临床应用广泛，疗效显著[10]。补阳还五汤药物组成主要有黄芪、当归尾、赤芍、地龙、红花、桃仁、川芎。根据“气旺而促进血行，血畅则络脉通”的中医理论，本方重用黄芪大补脾胃之元气，当归尾活血不伤血，佐以赤芍、川芎、桃仁、红花、地龙以通经活络、活血祛瘀，所有药物合而用之则有补气活血、祛瘀通络之效[11]。现代药理研究发现，补阳还五汤能够改善微循环和血流动力学，具有抗炎、调节免疫的作用[12]。

MIRI机制较复杂，主要原因有氧自由基增多、钙超载、能量代谢障碍、血管内皮炎性损伤和细胞凋亡等[13]。本实验选择缺血预适应组作为补阳还五汤的阳性对照，是根据Murry[14]提出的缺血预适应理论，即多次反复的短时间(2-10 min)缺血会让心肌产生耐受，对心肌产生自我保护作用。这种保护效应可持续1～3 h，进而延缓心肌细胞的损伤和凋亡。Murry认为，对于MIRI的防护可以从内源性保护机制入手，其机制可能与缺血预适应能够拮抗MIRI的发生因素(自由基增多、钙超载、能量代谢障碍、血管内皮炎性损伤和细胞凋亡等)有关，从而达到保护心肌的目的。当MIRI发生时，机体的一过性活性氧(ROS)急剧升高，使得心肌细胞发生氧化损伤，导致心肌细胞凋亡或死亡。机体的氧化防御酶，如SOD是清除这些氧自由基的重要抗氧化相关酶类，SOD活性的高低能够反映机体的抗氧化能力[15]。MDA是细胞膜脂质过氧化产物，MDA含量高低反映了氧自由基在细胞内生成水平及其对细胞的损伤程度[16]。NO是血管内皮细胞在NO合酶(NOS)作用下合成并释放的一种作用强大的内皮源性舒张因子(EDRF)，具有抗氧化的作用，再灌注期血管内皮发生炎症反应、钙超载等会导致NO含量降低[17]。本实验结果显示，补阳还五汤能够增加再灌注期SOD活性和NO含量，降低MDA浓度，说明补阳还五汤能够清除再灌注期内过多的ROS，减轻细胞膜脂质过氧化反应，防护再灌注期心肌细胞的氧化应激损伤，减少MIRI对心肌细胞的损伤。LDH、CK的活性水平是反映心肌细胞损伤程度的有效指标[18]，再灌注期心肌细胞受到氧化损伤，导致细胞膜通透性增加，心肌酶通过细胞膜进入血中，使血清中LDH、CK活性升高。本实验结果显示，补阳还五汤能够降低心肌酶LDH、CK的活性，证明补阳还五汤能够减少心肌酶向细胞膜的外漏，保护心肌细胞膜的完整性。

综上所述，在结扎30 min和再灌注120 min时间段，MIRI组大鼠心电图Ⅱ导联ST段均明显高于Sham组，表现为明显的缺血状态，证明造模成功。补阳还五汤预处理组和缺血预适应组在整个实验过程中，大鼠心电图、心肌酶等其他抗氧化指标差异均无统计学意义。本实验一方面证实补阳还五汤对MIRI大鼠心肌组织具有保护作用，其机制与减轻细胞膜脂质过氧化反应，防护再灌注期心肌细胞的氧化应激损伤有关。另一方面，以 Murry提出的缺血预适应理论中拮抗MIRI的发生因素为线索，通过补阳还五汤组与缺血预适应组作对照，证实缺血预适应能够增加心肌对缺血的耐受，引起MIRI大鼠心肌酶、抗氧化指标发生相应变化，减缓心肌细胞的凋亡，对心肌亦有一定的保护作用。关于其对血管内皮细胞炎症反应、钙超载等炎性指标及有关分子通路机制有待课题组的进一步研究探讨。