对氧磷酶在有机磷农药中毒中的研究进展

韩振坤，姜素文，吴霄迪

0 引言

对氧磷酶(Paraoxonase,PON)是一类能催化水解磷酸酯键的芳香酯酶，它既可水解有机磷酸酯、芳香羧酸酯及氨基甲酸酯等多种物质，又可减少过量过氧化物、氧化型磷脂的生成。PON1是其中发现最早、研究最多的一个成员,普遍存在于哺乳动物中，其中以肝脏及血液中活性最高。PON1能够水解有机磷的毒性代谢衍生物，是有机磷中毒预防和治疗的新途径。PON对有机磷酸酯毒性具有重要的保护作用，这种保护作用主要通过肝脏和血浆中的PON1对有机磷农药以及神经毒性物质的水解而发挥作用。本文对PON与有机磷农药中毒的关系及研究进展进行综述。

1 PON的生物学特性

1.1 生理、化学特征 PON为含255个氨基酸的蛋白物质，分子量为43～45 kD。PON中含有4个糖链，糖类占整个分子质量15.8%，除去糖后，酶蛋白分子量约为37 kD。PON存在于多种微生物、昆虫、鸟类及哺乳动物的体内，在哺乳动物中对氧磷酶主要由肝脏分泌，并广泛分布于多种组织，其中肝脏和血液中对氧磷酶活力最高。PON中氨基酸末端成分中有丰富的氨基酸残留基，在血清中主要与高密度脂蛋白(HDL)结合，形成颗粒状同源八聚合体结构。这种结构称作人类磷酸盐结合蛋白(HPBP)，是人类PON的天然伴侣，具有较高的生物学稳定性。研究表明，PON的活性和稳定性在很大程度上依赖HDL的分子环境，其中HPBP起到了非常重要的作用[1-2]。

1.2 PON的基因多态性 人类对氧磷酶是多基因家族，根据基因分布不同可分为PON1、PON2、PON3 3种高度同源的类型。在PON 3种类型中，只有PON1具有降解有机磷作用，其他类型PON具备抗氧化等能力。

人类PON1基因多态性主要表现在第192位点和第55位点上，即192谷氨酰胺(Q)/精氨酸(R)和55亮氨酸(L)/蛋氨酸(M)的变化。Mackness等[3]研究了这2种基因多态性对健康人血清对氧磷水解的影响，研究发现，第192位点、第55位点基因多态性和血清PON1的浓度分别占PON1活性变化的46%、13%和16%，其他参数均未显著影响其活性。

目前的研究表明，PON1酶活性及水平是由PON1基因多态性调控的，不仅与机体基因遗传有关，还与机体在有机磷中暴露程度和时间相关，有机磷农药暴露会影响人群血清PON1活性[4-5]。

1.3 PON的活性 人类PON活性在不同个体中差异较大，这种差异与基因多态性相关。不同种属之间对氧磷酶活性差异也较大，兔血清具有较高的对氧磷酶活性，鸟类对氧磷酶活性很低。临床研究发现，PON在人体中的生物活性不仅与人种相关，还与肝功能、高密度脂蛋白含量、遗传、是否吸烟等多种因素有关。

研究表明，一些药物能够影响酶的活性，贝特类降脂药物和花青素可诱导PON1的表达，增加血清中PON1的浓度[6-7]。目前发现，血清PON1活性越高对有机磷毒剂的抵抗力就越强。应用药物调节PON1活性可能在毒理学领域有潜在的应用价值。鉴于血清PON1水平在有机磷中毒治疗中的应用价值，基因检测有助于识别高危个体、评估和管理慢性有机磷中毒患者[8]。

2 PON纯化和其对有机磷毒性的防护作用

PON1生物活性越高，对有机磷降解速度和程度越高，有机磷中毒患者临床表现越轻。目前研究认为，PON1酶活性程度为有机磷中毒患者的保护因素。有学者通过给小鼠尾静脉注射含有PON1基因的重组腺病毒，显著减少了暴露于毒死蜱的小鼠全脑乙酰胆碱脂酶失活的程度，提高了血清PON1酶的水平和有机磷毒性的阈值。Fu等[9]使用裸DNA基因转染方法，给予小鼠尾静脉注射含有人PON1基因的真核表达质粒，分娩后24 h PON1表达良好。在使用致死剂量的梭曼毒性研究中，注射质粒组小鼠比对照组小鼠中毒症状轻，存活时间长，降低了死亡率。结果表明，通过裸DNA增加血清PON1，可以对梭曼的急性毒性提供保护。目前来看，用基因手段提高血清PON1水平预防有机磷中毒是一个可行的研究方向。

Furlong实验室在有机磷暴露前后通过给大鼠和小鼠注射从血清纯化的兔或人类PON1，结果表明，外源性PON1对有机磷中毒有显著的保护作用，证明了PON1治疗的潜在可能性，提出PON1可作为开发治疗有机磷中毒的方法[10]。Furlong实验室重组了有活性的人类PON1，并证明了对有机磷中毒的保护作用，该实验为其设计对有机磷暴露者有充分的保护作用的PON1成为可能[11]。

对氧磷酶存在于大多数动物血清中。对兔血清PON1进行分离提纯，结果表明,PON1能够有效降低大鼠血中敌敌畏浓度，与对照组相比，PON1对敌敌畏中毒大鼠具有明显的保护作用[12]。实验研究中直接将纯化的PON1注入动物机体中，体内环境和免疫功能会影响PON1酶活性，为了有效保持PON1的活性，我们试验性地制备了PON1脂质体，初步稳定性良好，酶活性稳定，极大地提高了PON1在大鼠体内的活性，并有效降低了清除率，延长了半衰期，改变了体内对氧磷酶的药代动力学，明显提高了对氧磷酶体内活性[12]，其机制有待进一步研究。

3 PON在有机磷中毒方面防治进展

传统的治疗有机磷中毒的方法是联合应用可对抗有机磷介导的乙酰胆碱酯酶抑制效应的药物和胆碱酯酶复能剂。使用原则提倡早期、足量、联合和重复用药。然而这些药物治疗都存在明显的副作用，例如，在没有胆碱能危象发生时，给予抗胆碱药阿托品，可引起由于毒蕈碱受体阻滞导致的中枢神经系统功能损伤，如神志模糊、烦躁不安、抽搐、昏迷等。氯磷定和碘解磷定等可产生短暂眩晕、头痛、血压和心率升高及心律失常等[13]。近年来，动物实验与临床病例报道发现，作为临床静脉营养的脂肪乳可作为脂溶性药物急性中毒的新型解毒剂[14]。脂肪乳在急性有机磷中毒患者的临床应用价值有待进一步研究。

当前的研究表明,PON1在有机磷酸代谢中具有重要作用，被认为是一个治疗有机磷暴露和中毒有前途的方法。经过多年的抗有机磷中毒治疗的探索，传统有机磷中毒的治疗和支持疗法表现出了其局限性。所以一直以来需要开发没有或者不良反应较少的药物，这个药物具有保护有机磷的暴露和暴露后的损伤作用。

在这种背景下，20世纪80年代末有机磷清除剂的概念形成。清除剂是在有机磷达到生理靶点时，可中和高毒的有机磷的酶或分离抗体。第一代生物清除剂是化学当量的清除剂，为了快速有效地解除有机磷中毒，必须应用大剂量的化学当量清除剂。催化作用的清除剂作为第二代生物清除剂，对有机磷底物有翻转效应。PON1作为一种自然存在于哺乳动物血浆中具有催化活性的生物清除剂，对有机磷有天然防护作用[15-16]。

化学当量清除剂如乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶等，一分子化学当量乙酰胆碱酯酶结合一分子有机磷，而酶钝化并失去了活性，为了快速有效地保护有机磷中毒，必须应用大剂量的化学当量清除剂。目前有研究表明，腺病毒介导的人丁酰胆碱酯酶活性表达持续，可保护宿主免受急性有机磷暴露[17]。而PON1作为催化作用的生物清除剂，对有机磷的清除过程是酶促水解反应，应用比较少的量就能产生相同或更大的对有机磷中毒的保护作用。因此，PON1是更有效并具有应用前景的治疗有机磷农药中毒的天然药物。

目前研究较多的是应用提纯或者利用生物和蛋白工程技术合成PON1，机体免疫系统会对外源性蛋白产生免疫排斥反应，药代动力学、毒理学及免疫学方面的研究资料目前较少。为解决PON1长期储存的稳定性、体内运行的稳定性和生物利用度等问题，PON1脂质体包裹方案提供了一个较好的思路，PON1脂质体酶活性稳定，极大地提高了PON1在大鼠体内的活性，并有效降低了清除率，延长了半衰期，改变了体内对氧磷酶的药代动力学，明显提高了对氧磷酶体内活性，为有机磷中毒患者的暴露和治疗开辟了新的机会[12,18]。

4 结语

PON作为一类能催化水解磷酸酯键的芳香酯酶，其降解有机磷酸酯的作用使PON对有机磷中毒有保护作用。PON1基因多态性和农药暴露显著影响人群血清PON1活性，未来基因检测有助于识别高危个体及评估和管理有机磷暴露者。重组有活性的人类PON1在有机磷暴露者的保护和治疗方面有潜在的应用价值，如果能利用此基因重组方式生产大量特定基因型的PON1，用于有机磷农药中毒等治疗，将为有机磷中毒的防治提供一种全新的安全有效的方法，预计将具有广泛的社会应用价值。