β-地中海贫血治疗的研究进展

杨花梅 孙菲，2 马燕琳，2，3，4，5 李崎，2，3，4，5

海南医学院第一附属医院1海南省人类生殖与遗传重点实验室，2生殖医学科（海口570100）；3海南省地方病（地中海贫血）临床医学研究中心（海口570100）；4海南医学院热带转化医学教育部重点实验室（海口570100）；5海口市人类遗传资源保藏重点实验室（海口570100）

β-地中海贫血［1］（β-thalassemia，简称β-地贫）是由于β-珠蛋白基因异常所致的单基因遗传病，呈世界性分布，而我国尤以华南、西南地区发病最高，其中广东、广西、海南以及云南是地中海贫血的高发省份［2］。β-地贫临床症状轻重不一，可分为轻型、中间型及重型，其治疗方法也有所不同。输血和铁螯合是目前治疗地贫的常规方法，部分患者需终生依赖输血及铁螯合来维持生命。该方案虽改善了患者的生存质量，但是长期的输血和铁螯合也带来了与输血相关的感染和器官损伤等风险，也无法解决该疾病固有的遗传原因［3］。异体造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）是目前已经证实的临床治愈地贫的唯一方法，如果在输血传播感染和铁超载等并发症发生之前进行HSCT，能够显著提高患者的生存率至90%［4］。但只有一小部分患者有合适的捐赠者，且清髓性HSCT 的死亡率达5% ～10%，移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）、不良免疫反应和医疗费用高等原因导致该治疗方法的局限性，无法广泛应用［5］。

在过去的几十年里，人们一直在研究基因治疗方法治愈单基因血液遗传病。β-地贫是点突变引起的单基因遗传病，其利用自体造血干细胞进行基因治疗成为近些年的研究热点。异体HSCT仅限于有人白细胞抗原（human leukocyte antigens，HLA）同源供体的患者，而使用自体造血干细胞进行基因治疗能够为异体HSCT 提供一种替代的治疗方法［5］，不仅避免了GVHD，而且治疗所需的调节方案中不需要免疫抑制药物，使异体HSCT 受限的患者也可以进行转基因细胞的输注，这明显扩大了治疗的适用范围。

1 β-地贫的发病机制及临床表现

β-地贫的发生是由于位于11 号染色体短臂第1 区第5 号带第5 亚带（11p15.5）的β-珠蛋白基因突变和∕或缺失，β-珠蛋白肽链的生物合成减少（β+-地贫）或完全被抑制（β0-地贫），使构成血红蛋白的α-珠蛋白肽链和β-珠蛋白肽链间的平衡被破坏，导致正常血红蛋白合成减少或者无法合成，病情迁延导致慢性贫血。与此同时，α-珠蛋白肽链相对增多，未结合的α-珠蛋白肽链极难溶解，相互集聚形成不稳定产物，该产物损害和破坏红细胞前体导致无效红细胞生成，在子代细胞中沉淀导致红细胞溶血，最终患者在临床上表现出不同程度的贫血。在造血组织中迟发和死亡的红细胞前体的大量扩张会导致骨缺损、肝脾肿大和铁超载。而慢性贫血会导致组织氧合不良和EPO 升高；无效红细胞生成和慢性溶血又会使患者血液处于高凝状态，增加血栓风险。无效红细胞生成和慢性组织缺氧也会抑制铁调素（铁的负性调节激素，减少机体铁的吸收）的合成和分泌，使循环中铁调素降低，引起一系列反应导致全身铁代谢异常。针对无效红细胞生成及铁失调，目前有多项研究获得了积极性成果［5-6］。

根据现有数据，已经发现了超过200 个导致β-地贫的基因突变［7］，不同的基因缺陷组成不同的表型，而拥有同样表型的个体也会表现出不同的临床症状，后者可能由于表观遗传因素影响所致。临床上根据其严重程度不同将β-地贫分为轻型、中间型和重型［3］。如今，根据患者输血需求，又分为输血依赖性地贫（transfusion-dependent thalassemia，TDT）和非输血依赖性地贫（non-transfusion-dependent thalassemia，NTDT）。TDT 与NTDT这种分类仅代表患者被当下诊断时的一个临床水平，其可以根据患者是否积极治疗的情况而发生临床转换，故同一患者的输血要求应间隔的进行重新评估［5］。

后来发现，合并有α-地贫的β-地贫患者，由于缓和了α-珠蛋白肽链与β-珠蛋白肽链之间的不平衡状态，临床症状减轻［8］。更加值得注意的是，伴有遗传性胎儿血红蛋白持续状态（hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）的β-地贫或镰状细胞病（sickle cell disease，SCD）突变的个体，由于胎儿血红蛋白（HbF）弥补了成人血红蛋白（HbA）的不足，在某些情况下患者完全无临床表现［9］。这些临床观察表明，利用其作为一种治疗疾病的手段，诱导重型β-地贫患者产生HbF、减少α-珠蛋白基因的产生均能起到治疗作用。

2 治疗进展

2.1 输血、铁螯合和脾切除重型β-地贫（属于TDT）在出生后不久就会表现出严重的贫血症状，除自身无法合成血红蛋白外，还会形成包涵体进一步产生其他并发症，故这类患者需要终身规律输血治疗以维持患儿正常身体发育所需，以及控制潜在的病理生理机制。中间型β-地贫（属于NTDT）主要表现为轻至中度的贫血，患者自身能够合成部分血红蛋白，故这类患者只需偶尔在特定时期内（如手术、怀孕和感染）进行输血，以提高血红蛋白浓度。轻型β-地贫由于临床症状不明显或者几乎无临床症状而无需输血治疗［3］。

但由输血导致的血源性感染、同种异体免疫反应，尤其是全身多个器官的铁超载问题，会使患者又产生一系列与铁代谢相关的并发症，患者要进行铁螯合至关重要。而β-地贫患者本身表现出的无效红细胞生成以及由此导致的红细胞运输氧的能力下降而形成的组织缺氧，影响铁调素的合成和分泌，使机体发生铁过载，若不及时除铁，会导致心肌病、肝纤维化或肝硬化、内分泌疾病等并发症［1，5］。根据国际地贫联盟指南，对于TDT 患者，当血清铁蛋白超过1 000 μg∕L 时，就要进行铁螯合治疗。而对于NTDT 患者，血清铁蛋白超过800 μg∕L，就要进行铁螯合治疗。目前常用的铁螯合药物为去铁胺、去铁酮、地拉罗司［1］。

大量无效红细胞的生成会使得脾脏对其破坏增加，导致脾肿大、脾亢，故合并症状性脾肿大、脾亢者可进行脾切除。对于不能接受输血和铁螯合治疗的患者，也可进行脾切除治疗［1］。脾切除的主要目的是为了降低血液消耗、输血需求，最终减少铁负荷。由于目前输血方案的日趋完善，对于TDT 患者来说，脾切除已经过时。除此之外，脾脏本身对机体中的有毒铁有一定的清除作用，并能清除异常的血小板和红细胞。一旦切除，随着时间推移会出现血栓形成、铁超载及严重的术后感染（如脑膜炎和败血症）等并发症。尤其是5 岁以下的儿童，脾切除年龄与术后感染的风险呈负相关［3，5］。

2.2 异体造血干细胞移植HSCT自80年代开创至今，已成为治愈重型地贫患者的一种重要手段［10］。欧洲血液和骨髓移植学会研究报道了2000 至2010年间进行HLA 匹配同胞供体移植的治疗情况，移植年龄≤18 岁的患者总生存率达（91±1）%、无事件生存率达（83 ± 1）%；与终生输血、铁螯合和并发症处理相比，HSCT 改善了重症患儿的生活质量［10］。尽管有数据支持HSCT 在HLA 匹配情况下更为理想，但是，找到组织相容性供体的可能性小于50%［11］。对于没有HLA 匹配同胞或者不相关供体的患者，可以选择HLA 不匹配的相关供体、HLA不匹配的不相关供体或者不相关脐带血进行移植［11］。但是该报告没有研究替代供体移植的结果。来自国际血液和骨髓移植研究中心的数据研究显示，与HLA 匹配的相关或不相关供体相比，HLA 不匹配的相关供体的无事件存活率及总存活率较低，患者5年无事件存活率在年龄≤6 岁组为86%，7 ～15 岁组为80%，16 ～25 岁组为63%。因此在疾病早期就开始同时寻找与HLA 匹配的相关和不相关供体，如果没有HLA 匹配同胞，则可以选择HLA 匹配的不相关供体进行移植［12］。

在历史上，骨髓是HSCT 的唯一来源。但在过去的20年里发生了转变，外周血干细胞正在逐渐取代骨髓干细胞成为HSCT 的主要异体来源。研究发现与骨髓来源相比，使用外周血来源的干细胞在生存率及GVHD 方面没有显著差异，且后者移植速度更快，排斥反应率更低，这也得益于调节方案的支持［13］。还有研究利用外周血、骨髓或脐带血无关供体移植，调节清髓方案以降低移植物的毒性作用，显著增加总体生存率［14-15］。

2.3 抑制无效红细胞生成红细胞生成是受细胞外和细胞内因子的复杂网络管制的。EPO 具有促进各类红系祖细胞和前体从早期的红系祖细胞晚期向早幼红阶段的存活和增殖。JAK2 是一种胞质酪氨酸激酶，可介导EPO 受体信号。EPO 与其受体的结合导致JAK2 的磷酸化，并激活对红细胞生成至关重要的通路［16］。应用JAK2 抑制剂（Ruxolitinib）在定期输血的地贫患者中进行其有效性和安全性的第2a 期实验表明，其可防止地贫红系细胞增殖和减少脾肿大，认为其在治疗地贫症状方面是有益的［17］。

Mini-hepcidin 和跨膜蛋白丝氨酸6（transmembrane protein serine 6，TMPRSS6）抑制剂，其Minihepcidin 能够模拟内源性铁调素的功能，TMPRSS6可减少铁调素的表达，故减少TMPRSS6 的表达即可促进内源性铁调素的产生。在小鼠模型中，服用Mini-hepcidin 或者抑制TMPRSS6 可显著改善无效红细胞生成、贫血和铁超载［18-19］。针对TMPRSS6 的反义寡核苷酸或小干扰RNA 的使用已被证明可以改善小鼠贫血、铁超载及其他β-地贫的临床前模型［20］。

生长分化因子11（growth differentiation factor 11，GDF11）通过转化生长因子β-受体负调节红细胞生成，并被活化素受体-II 配体陷阱（包括Sotatercept 和Luspatercept）阻断。有临床实验利用Sotatercept 和修饰后的Luspatercept 来阻断GDF11的活性刺激晚期红细胞的产生。关于Sotatercept第2a 阶段的用于确定其安全性和耐受性的剂量研究，有16 例TDT 和30 例NTDT 患者登记进行实验测试［21］。以及Luspatercept 第2 阶段的临床实验正在进行中，此次有64 名志愿者（31 例TDT 和33 例NTDT），其目的是确定其是否可以改善β-地贫患者的贫血和并发症，目前结果令人鼓舞［22］。现Luspatercept 在19 个国家进行第3 阶段的研究，该实验利用Luspatercept 与安慰剂对照，在都加上最佳支持治疗同时研究其在成人患者中的安全性和有效性，发现使用Luspatercept 的效果明显高于安慰剂组，患者表现为输血负担减轻，整个实验过程几乎无不良事件［23］。

2.4 基因治疗

2.4.1 慢病毒载体慢病毒属于逆转录病毒的一个属，具有逆转录和整合功能。现实验室和临床研究的慢病毒载体（lentiviral vector，LV）以HIV-1来源为主。LV 能够更有效的转导非增殖或者缓慢增殖的细胞，缩短培养时间而保证转导过程中造血干细胞的活力，而反转录病毒载体不能感染非增殖的细胞；且第三代自灭活LV 增加了整合的安全性，成为了现在最有效的载体工具［24］。

首个利用LV 治疗地贫的实验是由MAY 等［25］完成的，其将人β-珠蛋白基因准确、有效地整合到宿主DNA 中高效表达，并合成正常的血红蛋白。正是基于HIV-1 衍生的LV 的开发，LCR HS 促进β-样珠蛋白表达的发现。后来的多个实验室证明，在β-珠蛋白启动子和LCR 元件的控制下，携带人β-或γ-珠蛋白基因的LV 能够挽救小鼠和人β-地贫及SCD 表型，使利用LV 挽救β-血红蛋白病成为一种现实［26］。

在基因治疗发展的这几十年中，慢病毒系统结构在不断的优化。在第一阶段1∕2 临床实验中（LG001 于2006年在法国启动），MARINA 等［26］测试了HPV569 LV，该载体携带一个最小的β-珠蛋白启动子以及来自LCR 的HS2、HS3 和HS4 元素。将鸡β-珠蛋白HS4（cHS4）核染色质绝缘体的两个拷贝插入病毒LTR 中，但最终结果为载体滴度低、转导效率低、载体重排列且绝缘子元件丢失。基于这些原因，后来又经过基因整合设计了一个新载体（BB305），BB305 与HPV569 完全相同，只是缺少了cHS4 绝缘体。载体并进一步优化，包括用CMV 启动子替换50 个LTR 启动子，以驱动病毒RNA 生产，来提高载体效价，提高转导效率。2018年，THOMPSON 等［7］利用编码HbAT87Q 的BB305载体治疗（HGB-204 和HGB-205）22 例TDT 患者，其输血量明显降低，有3 例患者完全摆脱输血，均未发生药品相关的严重不良事件。第三阶段实验（HGB-207）评估LentiGlobin BB305 在输血依赖性地贫受试者中的有效性和安全性，目前正在进行中（https：∕∕www.clinicaltrials.gov∕ct2∕show∕record∕NCT 02906202）。

2.4.2 CRISPR/Cas9 技术成簇规律间隔短回文重复序列及CRISPR 相关蛋白（CRISPR∕Cas）［27］是该领域的最新参与者，因其简单、高效和多功能性而被认为是靶向和修饰基因组DNA 最有效和最先进的工具。

CRISPR∕Cas 系统［27］有三种类型，其中Ⅰ型和Ⅲ型系统由专门的核酸内切酶加工CRISPR-RNA（crRNA）前体（pre-crRNA）并使之成熟，每一个成熟的crRNA 会组装成一个大型的多Cas 蛋白复合物，能够识别和切割与crRNA 互补的核酸。而在Ⅱ型CRISPR∕Cas9 系统中，当外源的DNA 进入细胞时，就会引起细菌的RNaseⅢ即催化pre-crRNA的成熟，成熟的crRNA 只有与tracrRNA 配对后形成双链RNA，才能指导Cas9 在crRNA 引导序列靶标的特定位点剪切双链DNA。Cas9 是一种通用的核酸内切酶，含有HNH 和RuvC 两个核酸酶结构域，前者剪切互补链，后者剪切非互补链。要实现Cas9 对目标序列的切割，其不仅要完成crRNA 与tracrRNA 碱基配对，还依赖于原型间隔区相邻基序（protospacer adjacent motif，PAM）的存在。只要根据目标DNA 特异性重新设计sgRNA 序列，就可以将该技术应用于多种细胞类型的DNA 位点，最终改变基因的表达，从而CRISPR∕Cas9 技术是迄今为止最强大的基因编辑工具［28］。

有研究者利用CRISPR∕Cas9 技术直接修复突变的β-珠蛋白基因，恢复正常β-珠蛋白基因的表达［29-30］。研究发现，临床上仅患HPFH 的患者没有贫血症状，表明高水平的HbF 没有不良后果，故利用CRISPR∕Cas9 技术模拟自然发生的HPFH 相关突变作为一种治疗疾病的手段，如γ-珠蛋白启动子区-198T＞C HPFH 突变可与红系转录因子KLF1结合［31］、-113A＞G 为类红细胞调节剂GATA1 创建了从头结合位点［32］、-115 和-200 bp 处突变分别破坏γ-珠蛋白阻遏蛋白BCL11A 和ZBTB7A 的结合、删除β-珠蛋白基因中的13kb，模仿西西里人的HPFH 基因型［33］、删除包含δ-和β-珠蛋白基因以及BCL11A 结合位点在内的13.6kb 基因组区，均能诱导重型β-地贫患者表达更多γ-珠蛋白，甚至由成人期的≤1%达到5%～20%的HbF 水平［31］。

靶向γ-β珠蛋白基因转换的调节因子也可诱导HbF 的产生。实验发现BCL11A 通过其C 端ZnF簇在体内和体外以序列特异性方式结合γ-珠蛋白启动子中的DNA 基序（TGACCA），利用CRISPR∕Cas9 技术在体外编辑TGACCA 可防止BCL11A 结合并重新激活γ-珠蛋白表达。删除BCL11A 增强子内小基因组（200 bp）可以激活成人向胎儿血红蛋白的反向转换和HbF 的合成［34］。“核心”DRED复合物（由TR2、TR4、DNMT1 和LSD1 组成）其特异性结合人胚胎ε-珠蛋白和胎儿γ-珠蛋白DR1 启动子元件上，抑制γ-珠蛋白转录为成人红细胞，实验发现核受体辅阻遏物-1（NCoR1）和BRCA1相关蛋白1（BAP1）也是DRED 的重要组成部分，减少BAP1 表达明显诱导γ-珠蛋白转录。目前用CRISPR∕Cas9 修饰BCL11A 基因红系特异性增强子（CTX001）的早期临床实验正在进行安全性和有效性评估，及对受试者进行长期随访，其是首例重型β-地贫患者接受CTX001 实现治疗目的，减少输血 量 的 研究（https：∕∕www.clinicaltrials.gov∕ct2∕show∕NCT03655678；https：∕∕www.clinicaltrials.gov∕ct2∕show∕NCT04208529）。

在α-地贫患者中，单个α-珠蛋白基因缺失和2个α-珠蛋白基因缺失分别对应于mRNA水平和蛋白水平上α-珠蛋白输出减少25%和50%，这些水平可以被认为是β-地贫合理的治疗目标。但是其面临2 个挑战：第一，α-珠蛋白的损失不应该是完全的，任何超过75%的下降都将产生相反的效果，因失去大量α-珠蛋白链来产生血红蛋白而导致贫血恶化。第二，β-珠蛋白的产生不应受到影响。利用CRISPR∕Cas9 基因组编辑在人类造血干∕祖细胞（CD34+）上模拟自然突变，删除α-珠蛋白增强子MCS-R2 并造成α-地贫发现，患者α-珠蛋白减少且修正了珠蛋白的失衡，其实验并不影响CD34+的分化。

3 总结

β-地贫是一个涉及全球的遗传性疾病，尽管目前对地贫的宣传普及和管理得到了很大的改善，但是仍然有很多患者是未被发现的，以及针对已经诊断的患者的治疗也是并未完全受益到每一位患者。为此，全球也在不断探索研究更多新的方法能够普及每一位患者，改善其生活质量。目前在治疗上面，输血和铁螯合治疗对重型地贫患者来说仍是不可或缺的，而异体造血干细胞移植是根治地贫患者的唯一方法，利用自体造血干细胞进行基因治疗后再重新输回患者体内发挥治疗性作用，目前取得的鼓舞性成果为患者带来了更多希望。