针灸治疗干眼的作用机制研究进展

杨光,李茜莹,杨延婷,张丹,赵越,孔谐和,马晓芃,

(1.上海市针灸经络研究所,上海 200030;2.上海中医药大学,上海 201203)

干眼是以泪膜稳态失衡为主要特征并伴有眼干、眼痒、畏光、怕风、刺痛感、异物感、灼热感等眼部不适症状的多因素眼表疾病[1]。全世界范围内干眼的发病率约为 5.5%～33.7%,而在我国,干眼是眼科门诊最常见的疾病之一,仅次于屈光不正,越来越多的人受其困扰[2]。干眼病理机制尚未完全阐明,目前认为与免疫相关性炎症、细胞凋亡与自噬、神经调节异常和性激素水平失调有关,各发病机制相互关联,互为因果[3-5]。大量临床研究表明针灸能改善干眼患者主观症状,提高泪液分泌量(schirmer Ⅰ test, SⅠT),延长泪膜破裂时间(tear film break-up time, TBUT),且安全、无明显不良反应,患者依从性较高,可作为干眼的常规治疗方法[6-8]。同时机制研究方面也取得了较大进展。因此本文对针灸治疗干眼的作用机制作一综述,以期为临床针灸治疗干眼提供借鉴与思路。

1 改善眼表损伤

广义的眼表包括结膜、角膜、眼睑、泪器与泪道,其正常的结构和功能可维持泪膜的稳定性,稳定的泪膜不仅能保护和润滑眼表,还保证了视觉质量[9]。在眼表,泪液经历不断分泌、吸收、蒸发和流失的过程,处于一种动态平衡,任一环节引起的泪液质、量和动力学异常均可导致干眼,泪液稳态失衡是干眼发病的核心机制[10]。

1.1 改善泪腺结构,促进泪液的合成和分泌

水液是泪膜的主体,主要由泪腺腺泡上皮细胞合成与分泌。针刺可即刻增加泪液的分泌量,以水液性泪液为主[11]。在光镜下可观察到干眼模型兔腺泡内物质大量排空,腺泡上皮细胞萎缩,电镜下可见腺泡上皮细胞内有少量粗面内质网,胞浆较少,针刺或电针治疗后其腺体结构更加清晰,腺泡排空更明显,腺泡上皮细胞扩张,胞浆增多,胞内可见丰富的高尔基体,提示腺泡上皮细胞合成、分泌功能活跃,表明针刺或电针可显著改善泪腺形态,促进腺泡细胞的活动,增加水液性泪液的分泌[12-15]。

1.2 修复角膜、结膜损伤,增加黏蛋白分泌

角膜、结膜上皮细胞和杯状细胞分泌的黏蛋白(Mucin, MUC)具有高度亲水性和黏弹性,可稳定泪膜,维持黏膜屏障完整。MUC家族成员MUC5AC和MUC19为重要的成胶型 MUC,在杯状细胞共表达,具有抗菌和清除作用[16]。干眼可伴有角膜上皮细胞缺损、结膜杯状细胞丢失、鳞状上皮化生等眼表病理损伤,严重影响角膜、结膜分泌 MUC的功能,导致眼表 MUC5AC、MUC19表达降低[17-18]。临床研究发现,针刺治疗后干眼患者泪液黏蛋白总量增加[19],特别是 MUC5AC[20]。动物实验发现针刺或电针可增加干眼模型兔结膜杯状细胞密度,减轻结膜鳞状上皮化生,修复角膜上皮细胞缺损,并提高角膜、结膜和泪液中MUC5AC、MUC19的表达,提示针刺或电针可能通过改善角、结膜病理损伤,增加黏蛋白分泌[14,21]。

1.3 改善睑板腺萎缩,疏通睑板腺开口,促进脂质分泌

泪膜脂质来源于睑板腺分泌的睑脂,覆盖于泪膜最外层,有助于减少泪液蒸发[22]。睑缘皮肤过度角化造成的睑板腺腺口堵塞可引起睑脂堆积和慢性炎症,导致睑板腺萎缩、缺失,阻碍脂质分泌,睑板腺功能障碍(meibomian gland dysfunction, MGD)被认为是引起蒸发过强型干眼的主要病因[23]。针刺治疗后患者睑板腺分泌物排出较治疗前明显通畅,且分泌物变得清稀透亮,睑板腺功能得到改善,泪膜稳定性有所提高[24-25],泪膜脂质层厚度较前增加[26]。研究者通过比较单纯针刺、温针灸和电针对改善睑板腺功能的疗效发现,在攒竹(BL2)和太阳(EX-HN5)行温针灸可降低睑板腺缺失率,疗效优于单纯针刺[27],而电针与温针灸在改善睑缘形态和睑板腺缺失方面的疗效无显著差异[28]。MGD患者眼表温度降低,增加了睑脂的黏度,使得睑脂分泌不畅[29]。艾灸燃烧时产生的红外光辐射可穿透机体组织深达 10 mm[30],红外光能增加睑板腺腺泡直径及密度,降低炎症反应[31]。艾灸时穴位及周围皮肤温度可达 40℃以上[32],远高于睑脂熔点,可促进睑脂的熔化与流动。而电针的低频电脉冲能刺激腺体震动,也具有疏通腺体导管的作用[33]。因此,温针、电针疗法的特殊光热生物效应和物理作用可能是改善睑板腺形态,疏通睑板腺开口的重要机制,有助于改善睑板腺功能。

2 调节眼表细胞凋亡与自噬

细胞凋亡是由基因控制的细胞自主、有序的死亡。眼表细胞的异常凋亡抑制了其正常功能,同时抑制了淋巴细胞的免疫功能,发生眼表免疫炎症反应,促进干眼发生发展[34]。干眼模型兔泪腺导管及上皮细胞中的凋亡诱导因子Bax、Fas和FasL蛋白表达较正常组显著升高,凋亡抑制因子Bcl-2蛋白显著降低,针刺治疗后Bax、Fas和FasL蛋白表达显著减少,Bcl-2蛋白表达增加,提示针刺可抑制泪腺细胞凋亡[12,35]。此外,电针治疗后兔干眼模型结膜细胞中Caspase-3和Fas蛋白表达较治疗前也显著降低,Bcl-2蛋白表达降低,提示电针还可抑制结膜细胞凋亡[36]。以上研究表明,针刺或电针可能通过抑制结膜、泪腺细胞凋亡从而恢复眼表细胞正常功能,缓解干眼症状及病理损伤。

最近的研究发现自噬参与了干眼的发病,干眼角膜细胞自噬水平升高,激活细胞自噬可减轻角膜损伤,降低炎症因子表达,而抑制自噬可加重眼表损害,因此自噬可能是治疗干眼的新靶点[37]。电针可促进干眼模型大鼠角膜、结膜组织自噬体形成,自噬相关蛋白微管相关蛋白 1轻链 3Ⅱ(microtubule-associated protein 1-linght chain 3Ⅱ, LC3Ⅱ)的表达较模型组也显著上升,而选择性自噬接头蛋白(ubiquitin binding protein) p62表达显著降低,提示提高角膜、结膜细胞自噬水平可能是电针治疗干眼的机制之一[38]。

3 免疫调节机制

免疫相关性炎症是干眼恶性循环的关键环节,干眼也被认为是一种由眼表免疫失衡导致的黏膜自身免疫性疾病[39]。眼表高渗状态可破坏固有免疫系统的防御作用,激活炎症相关信号通路,启动适应性免疫反应,介导免疫炎症反应及组织损伤反复发作,导致干眼的发生发展[4,39-40]。研究表明,针灸可调节泪液免疫相关蛋白表达,抑制眼表免疫细胞活化,通过调控免疫相关信号通路调节炎症因子、趋化因子及其受体、基质金属蛋白酶(matrix metalloprotein, MMP)等的表达,从而抑制眼表免疫炎症反应,阻断恶性循环。

3.1 调节泪液免疫相关蛋白表达

泪液是眼表免疫系统的重要组成部分,泪液中除水液外还含有大量泪液蛋白可发挥特异性和非特异性免疫功能。乳铁蛋白(lactoferrin, LF)是主要的泪液蛋白之一,在眼表抗菌及免疫调节中起重要作用,干眼患者泪液LF水平降低。早期研究显示针刺治疗前后患者泪液LF水平无显著变化,但近年来研究针刺后泪液LF水平显著升高[41-42],与动物实验结果一致[21,43],提示针刺可能通过提高LF表达来抑制眼表炎症反应,需要进一步验证。

随着科学技术的发展,泪液蛋白质组学为研究针灸治疗干眼的作用机制提供了新技术新方法,如同位素相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ),二维纳米液相色谱耦合串联质谱法(two-dimensional nano-liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry, 2D Nano-LC-MS/MS)等,大大提高了检测的灵敏度和精确度。Qiu X等[44]应用传统的一维凝胶电泳,发现针刺可提高干眼模型兔泪液蛋白总含量,进一步应用iTRAQ标记联合2D Nano-LC-MS/MS技术证实,针刺后有 13种泪液蛋白出现差异表达,大部分蛋白与免疫反应相关,如α-1抗胰凝乳蛋白酶、载脂蛋白、富含组氨酸糖蛋白、S100-A9蛋白等。Liu Q等[45]同样采用iTRAQ标记联合2D Nano-LC-MS/MS技术比较了针刺联合人工泪液治疗和单纯人工泪液治疗前后绝经后期干眼患者的泪液蛋白,共筛选出 142个表达下调的蛋白和 169个表达上调的蛋白,蛋白功能分析表明针刺联合人工泪液组患者泪液中免疫相关蛋白表达较单纯人工泪液组显著升高。以上蛋白质组学研究结果提示,针刺主要调节泪液免疫相关蛋白表达,其对眼表免疫的调节可能是重要的作用机制。

3.2 抑制眼表免疫细胞活化

眼表具有多种常驻型免疫细胞,如IgA型浆细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、朗格汉斯细胞(langerhans cells, LC)、嗜中性粒细胞等,在眼表共同发挥免疫防御功能。在高渗透压、干燥应力的诱导下,多种眼表免疫细胞发生异常趋化和活化,反映眼表免疫状态失衡[46-48]。在光镜下,干眼模型兔泪腺和角膜中存在大量淋巴细胞浸润,腺体间质可见散在浆细胞、巨噬细胞和中性粒细胞,角膜共聚焦显微镜显示基质层LC增多且排列紊乱,电针或针刺治疗后腺体间质无明显淋巴细胞和浆细胞浸润,未见小灶性聚集及淋巴滤泡形成,LC显著减少,表明眼表免疫炎症反应减轻,提示电针或针刺可有效抑制多种免疫细胞的异常趋化和活化,调节眼表免疫[43,49-50]。

3.3 调节免疫相关细胞因子表达

免疫相关性炎症在干眼致病中的作用已达成普遍共识。各种细胞因子既是启动眼表免疫反应的驱动因素也是造成眼表损伤的重要效应因子。Zhang D等[51]应用蛋白芯片对比电针和单纯针刺治疗后有效病例、无效病例的结膜细胞因子,结果表明电针可调控单核细胞趋化蛋白 1、巨噬细胞集落刺激因子、基质金属蛋白酶组织抑制因子1、趋化因子RANTES的异常表达。其中趋化因子RANTES、基质金属蛋白酶抑制-1分别与SⅠT、TBUT呈负相关,电针治疗后二者表达显著下调,表明电针可能通过抑制T细胞趋化性提高SⅠT,通过抑制细胞外基质代谢平衡延长 TBUT。其他研究表明,针刺治疗后干眼患者泪液中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α、白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-4、IL-6、CXC趋化因子受体(CXC chemokine receptor, CXCR)3、CXC趋化因子配体(CXC chemokine ligand, CXCL)10的表达显著降低[52-53]。针刺、电针可下调干眼模型大鼠或兔眼表组织中转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β1、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18、主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)-Ⅱ的表达[15,21,38,54]。CXCR3是Th1细胞趋化因子受体,可与配体CXCL10共同诱导干眼免疫炎症,而 TNF-α是 Th1细胞的效应因子,可促进炎症反应;MHC-Ⅱ可激活抗原提呈,反映眼表免疫激活,其他细胞因子亦与干眼免疫炎症反应密切相关[55-56]。因此,针刺、电针可能通过调控眼表免疫相关细胞因子的表达抑制免疫炎症反应。

此外,针刺对干眼患者血清炎症因子也有调节作用,可降低血清 TGF-β、TNF-α、IL-1表达[57]。可见,针刺不仅能调控眼表局部免疫相关细胞因子的表达,还可能通过调节机体免疫功能抑制干眼局部免疫炎症反应。

3.4 调控免疫相关信号通路

在针灸调节免疫相关细胞因子表达的基础上,研究者进一步发现针灸对免疫相关信号通路具有调控作用。电针可显著降低干眼模型兔结膜、泪腺组织中Toll样受体(toll-like receptors, TLR)1/2/4/6的表达,降低核因子(nuclear factor, NF)-κB信号通路上游蛋白募集髓样分化因子88、TIR域的接受子蛋白、IL-1受体相关丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶及下游 NF-κB p65蛋白的表达,提示电针可能通过抑制 TLRs/NF-κB信号传导通路发挥免疫调节作用[58]。活性氧(reactive oxygen species, ROS)/NOD样受体蛋白(NOD-like receptor pyrin domain containing, NLRP)3炎症小体信号通路在干眼固有免疫中担任重要作用[59]。ROS的激活可使硫氧还蛋白(thioredoxin, TRX)释放硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin- interacting protein,TXNIP),游离的TXNIP与NLRP3绑定并促进炎症小体合成,释放下游炎症因子[60]。电针后,大鼠干眼模型角膜和结膜ROS含量降低,TXNIP、TRX、BRCA1-BRCA2的复合亚基 36蛋白酶、NLRP3炎症小体及下游炎症因子IL-1β、IL-18 表达显著降低,提示抑制ROS/TXNIP/NLRP3通路活化可能是电针治疗干眼的抗炎免疫调节机制[38]。可见,电针可能通过调控多条免疫相关信号通路抑制干眼眼表免疫炎症反应。

4 神经调节机制

泪腺腺泡、导管、肌上皮细胞和血管附近有大量副交感神经,副交感神经末梢含有乙酰胆碱(acetylcholine, Ach)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)等神经递质。VIP、Ach均为促进泪腺分泌水和离子的有效刺激因子。针刺或电针后干眼模型兔泪腺组织VIP、Ach浓度较模型组明显增高,且治疗后泪液量分泌作用时间较长,提示针刺或电针可提高 VIP、Ach,可能通过神经调节促进泪液分泌[61-62]。动物实验中,电针治疗后干眼模型兔泪腺Ach、M3AChR表达显著升高,p44/p42丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)表达显著降低[50]。Ach可与胆碱能受体结合形成M3AChR,激活胆碱能信号通路,而MAPK信号通路的激活参与干眼免疫炎症的发生发展,抑制该信号通路可减轻炎症反应,产生神经保护效应[63],因此电针可能通过调控MAPK信号通路,促进Ach分泌,发挥神经免疫调节作用。此外,JAK2/STAT3信号通路也是重要的神经免疫调节通路。针刺治疗后干眼模型兔泪腺Ach、α7烟碱型Ach受体(nicotinic acetylcholine receptors, nAchR)、JAK2、STAT3表达均显著升高,提示针刺可能通过上调Ach和α7nAchR表达,激活其介导的JAK2/STAT3信号传导通路,进行神经免疫调节[64]。

5 性激素调节机制

眼是性激素作用的靶器官,在泪腺、睑板腺、结膜、角膜组织中存在雄激素受体和雌激素受体。性激素水平失调可引起眼表免疫失衡或直接造成眼表组织、细胞的病变和功能障碍,导致干眼的发生发展[65]。雄激素水平降低可造成睑板腺、泪腺上皮细胞萎缩及功能减退,同时引发免疫炎症反应,与干眼发病关系较为明确[66]。多项研究表明,针刺可显著升高干眼患者血清睾酮含量,提示针刺可升高雄激素水平,以缓解眼表损伤[67-68]。雌二醇(estradio, E2)水平受下丘脑-垂体轴的调节,其升高和降低都会降低雄激素的生物利用度,从而导致干眼[66]。在不同研究中,针刺对干眼患者血清E2的调节作用存在差异。围绝经期干眼患者血清E2水平降低,促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)和促黄体生成激素(leuteinizing hormone, LH)水平升高,针刺可显著升高血清E2水平,降低FSH和LH水平[68-69],但对于干眼患者(年龄43～62岁,性别不限),针刺治疗后血清E2反而降低[67]。虽然E2在干眼发病机制中的作用尚不明确,但针刺上调雄激素水平作用确切,可通过调节机体性激素水平,改善干眼症状。

6 小结与展望

针灸治疗干眼疗效确切,虽然目前其作用机制尚未完全阐明,但现有研究显示针灸的作用机制是多靶点且复杂的,可通过改善眼表结构及功能异常、调控眼表细胞凋亡与自噬、抑制全身及眼表免疫炎症反应、促进神经递质分泌、神经调节和性激素调节多方面,促进泪液合成与分泌,修复眼表损伤,恢复泪膜稳态,从多个环节入手遏制干眼发病机制的恶性循环。免疫调节是针灸治疗干眼的重要机制,以整体性和双向性为特点[70]。已有的研究主要集中在针灸调控炎症因子表达上,对免疫细胞功能和炎症相关信号通路的研究较为粗浅。根据本文所述,针灸同时具有免疫调节、神经调节和性激素调节作用,但三者之间的联系尚不明确。未来,在深入研究针灸三种调节机制的基础上可着眼于针灸对神经-免疫-内分泌网络的调控机制,进一步探讨其整体效应。此外,作为近年来的研究热点,自噬与免疫、神经损伤相关,但在干眼发病机制中的研究尚处于起步阶段。多项研究表明针灸对于自噬具有一定的调节作用[71-72]。初步研究发现电针可提高干眼眼表细胞自噬水平,进一步研究针灸调节自噬对眼表炎症、神经损伤的作用将对阐释干眼发病机制,发现治疗新靶点具有重要意义。