Tim-3与胃癌肿瘤相关巨噬细胞的关系及艾灸调节作用的研究进展

徐静,黄艳,,吴璐一,李昆珊,顾沐恩,马喆,刘雅楠,郑寒丹,黄儒德,刘慧荣,,李璟,吴焕淦,

(1.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院,上海 200437;2.上海市针灸经络研究所,上海200030;3.上海市气功研究所,上海 200030)

胃癌的发病与幽门螺旋杆菌[1]、EB病毒[2]、遗传因素[3](CDH1、CTNNA1等胃癌相关基因变异)和环境因素[4](高盐、低果蔬饮食,吸烟)有关,目前研究机制聚焦于胃细菌微生物群[5]、细胞外基质[6]、microRNA[7]等对胃癌的作用。其中,T细胞免疫球蛋白及黏蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin-domain containing molecule 3, Tim-3)在胃癌的发生发展中十分重要[8],调控 Tim-3在肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages, TAMs)上的表达,使TAMs由M2向M1型极化,有望成为肿瘤免疫治疗的新方向[9-11]。目前胃癌的西医疗法主要依赖于外科手术,术后行放疗、化疗、分子靶向治疗,给患者带来了巨大的经济负担,严重影响其生活质量。中医艾灸疗法对胃癌有抑瘤、延长生存期、提高生活质量和减轻化疗不良反应等作用,是一种有效的治疗手段[12]。艾灸可激活巨噬细胞功能,提升巨噬细胞的吞噬能力及细胞毒作用,增加肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、一氧化氮(nitric oxide, NO)、白介素-1(interleukin-1, IL-1)等M1型巨噬细胞相关促炎抗肿瘤因子的分泌,发挥巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬、清除作用,或通过免疫检查点分子Tim-3对巨噬细胞极化产生影响,发挥艾灸抗炎免疫、抗肿瘤的作用。本文对抑制性免疫检查点分子Tim-3在胃癌患者TAMs极化调控作用以及艾灸治疗胃癌的效应机制进行探讨,现报道如下。

1 Tim-3对胃癌患者TAMs极化调控作用

1.1 TAMs极化影响胃癌肿瘤的发生、发展

TAMs大量存在于肿瘤间质细胞中,可分泌多种免疫抑制介质以促进肿瘤的生长和迁移[13]。在肿瘤及肿瘤相关间质细胞分泌的多种信号(CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CXCL12、CXCL8、CSF-1、EMAP2、MMP-9、MMP-12)的诱导下,血液中的单核细胞被招募到肿瘤组织中,并在肿瘤微环境中的细胞因子作用下极化成为两种不同类型的TAMs[14-15]。M1型经典活化巨噬细胞和M2型替代活化巨噬细胞的生物学功能近乎拮抗[11,16]。M1型TAMs能释放NO、ROS等肿瘤杀伤因子直接消灭肿瘤细胞[17],分泌 IL-1、IL-12、TNF-α等促炎因子刺激炎症反应,高表达MHCⅠ、MHCⅡ发挥抗原提呈作用,对抗肿瘤免疫逃逸[18]。M2型巨噬细胞分泌VEGF、PDGF、MMP、TGF-β等促血管生成因子促进肿瘤组织血管新生,高表达 IL-10诱导 Th2型免疫反应以促进肿瘤免疫逃逸[19-20]。TAMs极化对慢性胃炎向胃癌发展有重要作用。M1型巨噬细胞在慢性胃炎的炎症部位聚集,通过两条途径促使慢性胃炎向胃癌发展,①分泌TNF-α通过Wnt信号通路促进胃上皮组织恶变[21],②分泌 iNOS促使p53等抑癌基因突变,影响其表达,促进胃癌发展[22]。M2型TAMs数量在进展期胃癌中显著增高,诱导ki67、MVD的高表达,促进肿瘤细胞增殖与血管新生,与预后呈负相关[23-24]。

进展期胃癌中,肿瘤微环境释放的细胞因子能驯化TAMs向M2型极化,TAMs通过多种途径抑制机体免疫,加速胃癌进展。①分泌TGF-β、IL-10等抑炎症因子,抑制细胞表面 MHCⅡ类分子表达,减弱抗原提呈力,降低细胞毒作用。②分泌B7-H4[25]、可溶性FASL[26]、趋化因子CCL22[27-28]、刺激细胞凋亡蛋白酶-3活化[29],抑制CD4﹢T细胞活化、诱导CD8﹢T细胞凋亡、募集Treg细胞进入肿瘤组织,抑制T细胞介导的免疫反应。鉴于M1、M2型巨噬细胞近乎拮抗的生物学功能,有效调控M2型TAMs向M1型极化,是恢复巨噬细胞自身介导细胞毒作用,增强其抗原提呈能力,改善机体免疫抑制状态的关键。

1.2 Tim-3调控胃癌巨噬细胞极化的相关机制

抑制性免疫检查点分子Tim-3在免疫调节中起重要作用。Tim3是Tim家族中的重要成员,最初被作为区分Th1和Th2的特异性表面分子[30],能诱导T细胞凋亡,抑制Th1、Th17细胞功能,促进Th1细胞凋亡,负性调节机体免疫[31]。深入研究发现,Tim3还参与巨噬细胞极化的调控,其高表达会促使巨噬细胞向M2型极化,抑制炎症因子的分泌。Tim-3在M2型巨噬细胞上的表达水平远高于M1,且过表达Tim-3能降低M1型巨噬细胞的免疫应答,减弱炎性症状,而抑制Tim-3表达则会激活巨噬细胞的促炎功能,加重炎性症状[9,32-33]。Tim-3高表达于多种恶性肿瘤的TAMs中,Tim-3﹢TAMs的浸润程度和极化状态,与肿瘤的发生和迁移高度相关[34-35]。研究发现,肝癌、结肠癌中Tim-3过表达能诱导TAMs的M2型极化,伴随M2型TAMs相关分子Arg-1、CD206、IL-10的高表达及M1型相关分子TNF-α的低表达,抑制机体免疫功能,促进肿瘤生长,抑制Tim-3表达能调控M2型TAMs向M1型极化,免疫抑制分子表达下降,从而抑制肿瘤生长[36-37]。STATS家族在巨噬细胞极化调控中起重要作用。STAT1参与 M1型极化调控,STAT6参与M2型极化[38-39]。Tim-3可影响以上这些因子的表达,形成巨噬细胞极性调控的信号通路。①Tim-3/STAT6,在肿瘤微环境中IL-3、IL-4分别与它们的受体结合,激活STAT6磷酸化,导致STAT6移位至细胞核,激活 M2巨噬细胞特异性靶基因的转录,例如CD206、Arg-1等[40]。阻断Tim-3可使巨噬细胞中STAT-6磷酸化水平显著降低,伴随M2型巨噬细胞减少,Arg-1、CD206表达降低,有效抑制巨噬细胞 M2极化[36]。②Tim-3/STAT1/miR-155,STAT1可上调 microRNA miR-155的表达[41],miR-155降解SOCS1、C/EBPβ等目的蛋白mRNA,降低SOCS1、C/EBPβ的表达水平,SOCS1、C/EBPβ是抑制 M1极化、促进 M2极化的关键分子。Tim-3能招募STAT1进入肿瘤组织并与之结合,从而抑制STAT1活化及入核,降低miR-155的转录水平,进而上调SOCS1的表达,导致Arg-1和IL-10表达增加,促进巨噬细胞的M2型极化[37]。详见图1。

图1 Tim-3调控肿瘤相关巨噬细胞极化的途径

2 艾灸治疗胃癌的效应及其相关机制

2.1 艾灸治疗胃癌的效应

中医学认为,肿瘤的病理性质属本虚标实,或因邪致虚,最终正虚邪实。癌毒作为一种特殊毒邪,是肿瘤发生的特异致病因素。肿瘤具有损耗正气、酿生痰瘀的致病特性。痰、毒、瘀等病理产物交融夹杂,导致痰毒内结,气滞湿蕴,瘀血内阻,津液代谢异常,癌病乃成。艾灸对胃癌的辅助治疗效果已得到公认,诸多研究表明艾灸不仅能减缓瘤体生长速度、缩小实体瘤体积,对胃癌术后恢复及缓解放化疗不良反应亦有显著效果。温和灸能提高胃癌患者免疫功能[41],缓解晚期胃癌患者癌痛[42],促进胃癌术后胃肠功能恢复,缩短患者排气时间,减少术后并发症,提高患者生活质量[43-45];抑制荷瘤大鼠瘤体生长,促进肿瘤细胞凋亡,减少血管增生[46-47]。隔药灸、化脓灸能有效缓解胃癌患者化疗引起的恶心、呕吐、乏力及骨髓抑制症状[48-50],此外,隔药灸能改善消化道肿瘤术后胃瘫的临床症状,缩短胃管留置时间[51]。雷火灸可有效缓解胃癌患者化疗后疲乏症状[52]。麦粒灸能改善胃癌患者化疗后骨髓抑制症状,降低进展期胃癌患者血小板数量、改善患者高凝状态,减轻胃癌患者的临床症状,如疲乏、睡眠困难以及消化系统的恶心呕吐、食欲减退、腹胀、便秘等,对胃癌术后胃瘫综合征亦有显著疗效,在提高患者生活质量、延长生存期方面有重要作用[53-56]。

2.2 艾灸治疗胃癌的相关机制

艾灸具有“疫苗样效应”,能调节免疫微环境,促进免疫细胞的增殖和活化,参与固有免疫及适应性免疫,从而影响免疫相关细胞因子的分泌,实现脏腑和整体的免疫调节,能有效对抗肿瘤免疫逃逸,发挥抗肿瘤作用。其中,直接灸/麦粒灸因贴于皮肤表面燃烧,热力深透腧穴部位,对皮肤产生的灼痛感还可激发人体疼痛反应机制,并通过“创伤-炎症-修复”刺激机体产生异体蛋白,进一步提升机体免疫力,达到治疗肿瘤的目的[57-58]。

2.2.1 艾灸对巨噬细胞的调节作用

巨噬细胞受肿瘤微环境影响极化为M2型,其吞噬能力及细胞毒作用受到抑制,表现为免疫抑制状态。目前尚缺乏艾灸对胃癌相关巨噬细胞极化调节的研究,但在其他类型的肿瘤中,艾灸对于巨噬细胞功能的调节作用已经得到证实。艾灸可提升巨噬细胞的吞噬能力及细胞毒作用,增加TNF-α、NO、IL-1等M1型巨噬细胞相关促炎抗肿瘤因子的分泌,发挥巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬、清除作用。饶本强等[59]对艾灸的抑瘤作用及机制进行初步探索,发现艾灸组的巨噬细胞吞噬率和吞噬指数均显著高于对照组,表明艾灸可激活巨噬细胞活性,艾灸关元穴对荷瘤小鼠移植瘤的生长有明显的抑制作用,且艾灸组肿瘤细胞坏死面积更广泛、分化程度更高,表明艾灸组巨噬细胞的吞噬活力增高,机体免疫功能提高,艾灸的抑瘤作用与其能提高机体免疫功能有关。杨志新等[60-61]发现,小鼠荷瘤后巨噬细胞吞噬功能显著降低,M1型巨噬细胞相关分子TNF-α、NO的分泌水平显著下降,艾灸干预能显著抑制瘤体生长,能显著提升巨噬细胞吞噬率、吞噬指数及杀伤活性,并提高TNF-α、NO的分泌水平。此外,实验研究表明,艾灸通过增强巨噬细胞吞噬能力改善肿瘤化疗后机体免疫抑制状态。采用环磷酰胺化疗后的小鼠免疫功能受到抑制,艾灸大椎穴对免疫功能低下小鼠的巨噬细胞吞噬功能具有显著的增强作用,改善免疫低下状态,提高小鼠非特异性免疫功能[62-63]。麦粒灸治疗可显著提升环磷酰胺化疗后小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage-colony stimulating factor,GM-CSF)的表达。GM-CSF能提升巨噬细胞活性,增强其吞噬作用,提高其抗原提呈能力[64]。艾灸对巨噬细胞的调节作用不仅体现在肿瘤中,研究表明在风湿性关节炎[65]、腹腔急性感染[66]及免疫抑制病理状态下[67],艾灸大椎、中脘等穴可显著增加巨噬细胞的数量、吞噬指数、吞噬率及细胞毒作用且免疫抑制模型动物的效果显著优于正常机体。

2.2.2 艾灸对 M1/M2型巨噬细胞相关细胞因子的调控作用

艾灸可增强IL-12、TNF-α等M1相关促炎因子分泌,刺激机体免疫功能。IL-12可增强T细胞介导的免疫应答,发挥免疫调节作用和抗肿瘤效果。麦粒灸可增加 IL-12在肿瘤化疗患者外周血中的表达[68]。TNF-α能直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性,是高效抗肿瘤因子。TNF-α可降低溶酶体稳定性,促使酶外泄,细胞溶解[69];能激活磷脂酶 A2,释放超氧化物引起DNA断裂[70];能促进靶细胞糖酵解,降低细胞内pH值,扰乱代谢直接杀伤肿瘤细胞[71]。对胃荷瘤大鼠进行艾灸干预发现,艾灸组大鼠 TNF-α含量较模型组显著增加,提示艾灸通过增强 TNF-α的分泌抑制胃癌肿瘤的生长[72]。M2型巨噬细胞分泌的IL-10、VEGF能促进肿瘤组织血管新生。IL-10具有免疫抑制作用,是肿瘤免疫逃逸的机制之一。研究发现,胃癌模型大鼠癌组织IL-10明显增高,隔姜灸干预后胃癌组织IL-10含量较胃癌模型大鼠明显降低,隔姜灸可能通过降低大鼠胃癌组织中IL-10含量而达到治疗胃癌的目的[73]。VEGF是一类具有高度特异性的癌细胞生成作用细胞因子,能促进肿瘤微小血管的形成和延伸。动物实验发现,胃荷瘤大鼠胃组织中VEGF含量显著增加,温和灸足三里能显著降低 VEGF含量,温和灸可能通过抑制 VEGF分泌,加速胃癌组织缺血坏死[74]。

2.2.3 艾灸通过JAK1/STAT5途径调控巨噬细胞功能抗肿瘤

艾灸能显著提高胃癌小鼠 JAK1、STAT5的表达,JAK1/STAT5通路的激活调控相关基因表达并发挥抗肿瘤作用[75]。研究表明,STAT5的活化可促进miR-155的转录[76]。miR-155是巨噬细胞M1型极化的关键因子,推测麦粒灸的抗肿瘤作用或与M1型极化有关。

2.2.4 艾灸对T细胞的调控作用

对胃癌化疗患者进行艾灸治疗能显著提高患者CD3﹢T细胞、CD4﹢T细胞含量,下调细胞毒性CD8﹢T细胞含量,提高CD4﹢T/CD8﹢T比值,抑制淋巴细胞凋亡,提高肿瘤患者的淋巴细胞转化率,改善免疫抑制状态,起到抗肿瘤效果[77-79]。

2.2.5艾 灸对NK细胞及NLR的调控作用

NK细胞对肿瘤细胞具有直接杀伤作用[80-81],且活化的NK细胞具有更显著的肿瘤清除作用[82-83],因而增强 NK细胞的含量及其杀伤活性对防治肿瘤具有重要意义。艾灸对胃癌患者 NK细胞数量具有显著提升作用[71-72],且在动物实验中得到验证,胃癌荷瘤大鼠模型组比较,艾灸组大鼠干预中、后期体质量,食量增加,NK细胞数量显著增加,表明艾灸能增加胃癌SD大鼠体质量,恢复食量,改善胃癌大鼠状态,其机制可能与NK细胞含量增加,细胞免疫增强有关[47]。中性粒细胞-淋巴细胞比率(neutrophil to lymphocyte ratio, NLR)是胃癌预后的独立相关性的炎性指标。高NLR患者的淋巴结转移率、远处转移率高,总生存期短,预后较差[84-85]。麦粒灸足三里及胃俞能降低进展期胃癌患者NLR水平,改善胃癌患者免疫功能,提升生命质量[86]。

3 讨论

国内外艾灸研究已论证了其辅助治疗胃癌的作用,主要集中在抑瘤作用、调高机体免疫力、改善化疗后骨髓抑制及临床症状,在一定程度上指导了临床艾灸抗肿瘤的实践。艾灸疗法的“疫苗样效应”抗肿瘤机制尚处于探索阶段。艾灸辅助治疗胃癌可提高巨噬细胞的吞噬能力,这项研究成果初步揭示了艾灸抑制胃癌肿瘤生长的机制。近年来,Tim-3对肿瘤相关巨噬细胞极化调节作用越来越被重视,艾灸对胃癌患者穴位的局部刺激,或可通过调节局部穴区、低级中枢和高级中枢、远端靶器官胃癌组织中Tim-3的异常表达,影响肿瘤相关巨噬细胞由M2型向M1型极化,发挥抗炎免疫和抗肿瘤的作用,达到改善胃癌患者的临床症状、体征,提高生活质量之目的。今后研究方向可聚焦胃癌组织中作用于肿瘤相关巨噬细胞的 Tim-3生物学功能,探索Tim-3作为免疫检查点分子在艾灸治疗胃癌患者潜在的抗肿瘤机制。基于艾灸临床治疗胃癌有效,可从组织水平、细胞水平、体内水平的不同层面,研究艾灸调节胃癌 Tim-3的异常表达,继而调控肿瘤相关巨噬细胞M2向M1极化。临床募集胃癌患者及健康体检者,对胃癌患者进行艾灸干预,采集艾灸前后胃癌患者血清及健康体检者血清,比较健康状态及艾灸前后Tim-3、M1/M2巨噬细胞数量及M1/M2巨噬细胞相关分子 TNF-α、IL-1、IL-2、IL-12、TGF-β分泌水平的变化。制备胃癌大鼠模型并分为正常组、模型组、艾灸组、西药组,比较不同组间瘤体变化,M1/M2巨噬细胞相关分子 TNF-α、IL-1、IL-2、IL-12、TGF-β分泌水平的变化,观察血清、癌组织及癌旁单核巨噬细胞Tim-3的表达水平。探索Tim-3/STAT1/miR-155途径对巨噬细胞极化的调控作用,制备胃癌大鼠模型并分为正常组、模型组、艾灸组、西药组,检测黏膜组织Tim-3、STAT1、p-STAT1表达,比较不同分组的巨噬细胞中Tim-3、STAT1及miR-155表达差异。另一方面,今后研究可探讨 Tim-3在癌前病变慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis, CAG)中的具体作用,一般认为胃癌沿“慢性浅表性胃炎→慢性萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型增生→胃腺癌”方向发展[87],CAG作为胃癌前疾病,与胃癌发生发展密切相关,明确Tim-3在艾灸治疗CAG中主要的抗炎免疫机制,完善艾灸对CAG、胃癌抗炎免疫和抗肿瘤作用的理论基础,明确艾灸纠正 CAG胃黏膜组织形态学改变,可阻遏胃癌发生、发展的作用,提高艾灸治疗 CAG、胃癌的疗效,促进其在临床上的进一步应用。