骏枣的多糖提取及其蛋白脱除研究

曹泽虹，董玉玮，李 超,张广亮

(徐州工程学院 食品(生物)工程学院/江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室/江苏省食品与生物工程实验中心， 江苏 徐州 221008)

和田骏枣(ZiziphusjujubaMill. cv Junzao)又叫和田玉枣，是中国新疆地理标志产品，也是无公害绿色产品[1]。由于和田地处新疆南部，干旱少雨，光照时间长，昼夜温差大，因此和田骏枣的质量明显高于其他枣类，富含多糖、维生素、微量元素及黄酮类等生物活性物质。许多实验结果表明，红枣多糖具有提高免疫力和抗氧化的生理功能，可以补气养血、预防心血管疾病，还有抗补体活性、抗肿瘤活性和促进淋巴细胞增殖的作用[2-4]。

采用水溶提取法提取红枣多糖[5]，具有无需大型设备、操作简单安全性好、成本低、提取率高等优势，适合工业化大规模生产[6]。由于提取工艺的限制，在红枣多糖中往往会掺有一些蛋白质，影响其品质[7-8]，对红枣多糖中蛋白质进行脱除，可以提高红枣多糖的纯度和品质。

本研究以和田骏枣为研究材料，探究利用水提法提取红枣多糖的工艺流程，以及红枣多糖的蛋白脱除方法，以期为红枣多糖的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

和田骏枣(ZiziphusJujubaMill. cv Junzao)，购买于徐州市大润发超市。

G- 250蛋白试剂，中国惠兴生化试剂有限公司；考马斯亮蓝，天津市益力化学试剂有限公司；实验用水为蒸馏水；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

7230G型可见分光光度计、FA2104N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；PC- 1000型数显式电热恒温水浴锅、GZX- DH- 600型电热恒温干燥箱，上海跃进医疗器械厂；L550型低速离心机，常州国华电器有限公司；FAD- 100A型组织粉碎机，华东冶矿机械厂；BCD- 13OH TB型海尔冰箱，青岛海尔股份有限公司。

1.3 红枣的预处理

研究所用红枣的预处理方法见图1。

图1 红枣的预处理流程

1.4 多糖的提取实验

1.4.1单因素实验设计

取5份红枣粉，每份1 g，以料液比、提取时间、提取温度3个因素进行单因素设计实验[9-12]。选取提取时间2 h、提取温度60 ℃的条件下进行料液比实验研究，料液比(m(红枣粉)∶V(水))选取1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL；选取提取温度60 ℃、料液比1∶25 g/mL的条件下进行提取时间实验研究，提取时间选取2、3、4、5、6 h；选取提取时间2 h、料液比1∶25 g/mL的条件下进行提取温度实验研究，提取温度选取 60、70、80、90、100 ℃，研究各因素对红枣多糖提取率的影响。

1.4.2响应面试验设计

在单因素实验基础上，采取Box- Behnken设计方法，对料液比、提取时间和提取温度进行响应面试验，以提取率为响应值，通过实验得到数据并对其进行分析，利用响应面法来优化提取工艺条件，由此可得到影响因素与响应值之间的拟合方程，生成响应面图[13-14]，并利用软件预测较佳工艺条件。

1.4.3多糖的提取

取称1 g红枣粉，按照较佳提取工艺进行提取，提取后离心，得到上清液，用旋转蒸发仪进行减压蒸发浓缩，在60 ℃的条件下蒸发20 min，得到浓缩液，缓慢加入4倍体积的体积分数为90%的乙醇溶液，放入4 ℃冰箱中冷藏12 h。将醇沉过夜的样品在5 000 r/min条件下离心25 min，离心后将上清液倒出，取出沉淀物，在-50 ℃、10 Pa的条件下，冷冻干燥24 h，称量得到一定质量的红枣多糖，计算粗多糖得率。

1.5 多糖蛋白的脱除实验

1.5.1多糖蛋白含量的测定

采用考马斯亮蓝G- 250法测定蛋白质的含量[7-8]。将红枣多糖溶解于100 mL纯水中，向试管中加入1 mL红枣多糖溶液、5 mL G- 250蛋白试剂，振荡均匀；2 min后，在595 nm波长处测吸光度，红枣多糖中蛋白质质量浓度(mg/g)的计算见式(1)。

(1)

式(1)中，C为由样品测定的吸光度代入回归方程得到的蛋白质质量浓度，μg/mL；V为样品提取液的总体积，mL；P为稀释倍数；10-3为将μg换算成mg的转换系数；W为称取的红枣粉质量，g。

1.5.2多糖蛋白脱除率的测定

蛋白质脱除率的计算见式(2)。

(2)

式(2)中，A0表示脱蛋白前样品中蛋白质质量分数，mg/g；A1表示脱蛋白质后样品中蛋白质质量分数，mg/g。

1.5.3多糖损失率的测定

红枣多糖损失率的计算见式(3)。

(3)

式(3)中，B0表示脱蛋白前样品中多糖质量分数，g/g；B1表示脱蛋白后样品中多糖质量分数，g/g。

1.5.4多糖蛋白的脱除

1.5.4.1 Seveage法脱除

以m(红枣多糖提取液)∶m(正丁醇与氯仿的混合液)=5∶1的比例，在红枣多糖提取液中加入正丁醇与氯仿的混合液[V(正丁醇)∶V(氯仿)=1∶4]，混合均匀，用摇床震摇20 min，倒入分液漏斗中，静置30 min，分液。重复进行3次，分别测定红枣多糖提取液中和脱蛋白的红枣多糖提取液中的蛋白质含量[7-8]，进行蛋白质的脱除率和红枣多糖的损失率计算。

1.5.4.2 三氯乙酸法脱除

以m(红枣多糖提取液)∶m(三氯乙酸)=1∶1.5的比例，在红枣多糖提取液中加入体积分数为5%的三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)水溶液，混合均匀，在冰箱中静置4～6 h，在离心速度为4 000 r/min条件下离心15 min，除去沉淀，保留上清液，重复2～3次，进行蛋白质的脱除率和红枣多糖损失率的计算。

1.5.4.3 CaCl2法脱除

在红枣多糖提取液中用质量分数为2%的氢氧化钠水溶液调节pH值为8，并加热到85 ℃。将CaCl2加入提取液中，使其质量分数为5%，加热搅拌30 min，待溶液冷却至室温后过滤，滤液用2 mol/L稀HCl调整pH值至7。将滤液离心后收集上清液，重复2～3次，进行蛋白质的脱除率和红枣多糖的损失率计算。

2 结果与分析

2.1 多糖标准曲线方程的建立

分别吸取葡萄糖标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于大试管中，加入质量浓度为6%的苯酚溶液1 mL和硫酸5.0 mL，静置5 min，于100 ℃的水浴锅中水浴15 min，适当冷却，然后在490 nm波长处测其吸光度。以葡萄糖含量质量浓度(mg/mL)为横坐标，吸光度为纵坐标，建立的多糖标准曲线方程为C=15.245A+0.0147(R2=0.999 0)。

2.2 蛋白质标准曲线方程的建立

分别吸取蛋白质标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于试管中，再分别吸取蒸馏水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2及0.0 mL于试管中，最后在每个试管中加入5 mL考马斯亮蓝G- 250，混匀。按照1.5.1节方法建立蛋白质标准曲线。以蛋白质质量浓度(μg/mL)为横坐标，其吸光度为纵坐标，建立的蛋白质标准曲线方程为y=15.245x+0.014 7(R2=0.990 3)。

2.3 多糖提取条件的优化结果

2.3.1单因素实验优化结果

图2 料液比对红枣多糖提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on yield of jujube polysaccharide

2.3.1.1 料液比的影响

按1.4.1节进行单因素实验，料液比对红枣多糖提取率的影响结果见图2。

由图2可知，随着料液比的降低，红枣多糖在水溶液中的溶解度增加；但是当料液比达到1∶30 g/mL以后，红枣多糖的提取率又呈现出下降的趋势，这是由于溶剂和溶质之间的浓度差太大，反而会降低红枣多糖在水中的溶解度，使红枣多糖的提取率降低。因此当料液比为1∶30 g/mL时，红枣多糖的提取率最高，为40.07%。

2.3.1.2 提取时间的影响

按1.4.1节进行单因素实验，提取时间对红枣多糖提取率的影响结果见图3。

图3 提取时间对红枣多糖提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on yield of jujube polysaccharide

由图3可知，提取时间越长，多糖提取越充分。但是，当提取时间达到3 h后，则多糖结构会被破坏，因此导致多糖提取率下降。当提取时间为3 h时，红枣多糖的提取率最高，为45.27%。

2.3.1.3 提取温度的影响

按1.4.1节进行单因素实验，提取温度对红枣多糖提取率的影响结果见图4。

图4 提取温度对红枣多糖提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on yield of jujube polysaccharide

由图4可知，红枣多糖的提取率最初随着温度的升高而增加。这是因为随着水浴温度的升高，分子运动速度加快，因此多糖的提取率也增加。当温度达到85 ℃以上时，红枣多糖的提取率降低，因为过高的温度会破坏多糖的结构。当提取温度为80 ℃时，红枣多糖的提取率最高，为45.53%。

2.3.2响应面试验优化结果

通过单因素实验，得到水提法提取红枣多糖较佳单因素条件为料液比为1∶30 g/mL，提取温度为80 ℃，提取时间为3 h。根据此条件设计3因素3水平的响应面试验，确定提取红枣多糖的最佳工艺条件，响应面试验设计和结果见表1。

表1 多糖提取条件响应面试验设计和结果Tab.1 Response surface experimental design and resultsof extraction conditions of ploysaccharides

利用Design expert软件对表2数据进行拟合，得到提取率对以上三个因素的拟合回归方程为多糖提取率=45.23+1.43×A+0.53×B-0.020×C+0.72×A×B+0.17×A×C-0.27×B×C-2.89×A2-1.31×B2-0.37×C2，对该模型进行方差分析，分析结果表明，回归方程具有较高的拟合度和可信度，实验误差较小，表明模型的相关性非常好。回归系数R2>0.9，自变量与响应值之间存在线性关系，因此，回归方程可以进一步用来进行最佳提取工艺条件的优化，所以可以使用该模型来分析响应值的变化。根据回归分析结果，作出响应面图和等高线图，见图5。利用Design Expert软件对提取红枣多糖的最佳工艺条件进行预测，由图5可知，红枣多糖的较佳提取工艺条件是料液比为1∶30 g/mL，提取温度80 ℃，提取时间3 h，提取率为45.96%。

2.3.3验证实验

在响应面试验得出的较优条件下进行3次平行实验，测得的红枣多糖提取率平均值为45.86%，与预测值基本相符。

2.4 红枣多糖脱蛋白研究

2.4.1Seveage法脱除结果

用Seveage法进行红枣多糖的脱蛋白实验，脱蛋白前后蛋白质质量分数依次为5.91 mg/g和1.22 mg/g，蛋白质的脱除率为79.36%；脱蛋白前后多糖质量分数依次为0.46 g/g和0.35 g/g，红枣多糖的损失率为23.91%。

2.4.2三氯乙酸法脱除结果

用三氯乙酸法进行红枣多糖的脱蛋白实验，脱蛋白前后蛋白质质量分数依次为5.91 mg/g和1.06 mg/g，蛋白质的脱除率为82.06%；脱蛋白前后多糖质量分数依次为0.46 g/g和0.39 g/g，红枣多糖的损失率为15.21%。

2.4.3CaCl2法脱除结果

用CaCl2法进行红枣多糖的脱蛋白实验，脱蛋白前后蛋白质质量分数依次为5.91 mg/g和1.15 mg/g，蛋白质的脱除率为80.54%；脱蛋白前后多糖质量分数依次为0.46 g/g和0.37 g/g，红枣多糖的损失率为19.56%。实验结果表明，在3种多糖脱除蛋白的方法中，三氯乙酸法的蛋白脱除率最高，为82.06%，红枣多糖的损失率也是最低的，为15.21%。

3 结 论

通过单因素实验对水提法提取红枣多糖的工艺条件进行了研究，得到的较佳提取条件是料液比1∶30 g/mL、提取时间3 h、提取温度80 ℃。在单因素实验的基础上，采用响应面对红枣多糖提取工艺条件进行研究，建立了提取率和各个因素之间的数学模型，得到了红枣多糖提取的最佳工艺参数为m(红枣)∶V(水)=1∶30 g/mL、提取时间3 h、提取温度80 ℃，在此提取条件下，红枣多糖的提取率为45.86%。

图5 多糖提取响应面试验优化结果Fig.5 Optimum results of polysaccharide extraction by response surface methodology

采用Seveage法、三氯乙酸法和CaCl2法3种方法对红枣多糖进行了脱蛋白对比研究，结果表明，采用三氯乙酸法对红枣多糖中蛋白质的脱除效果最好、多糖损失率最低，多糖蛋白的脱除率为82.08%，多糖损失率为15.21%。