基于漫反射可见光谱无损检测生鲜牛肉和猪肉肌红蛋白

潘 嘹，董 迪，卢立新，*

(1.江南大学 机械工程学院， 江苏 无锡 214122；2.江苏省食品先进制造装备技术重点实验室， 江苏 无锡 214122)

生鲜肉及其制品是人类膳食的重要组成部分，其色泽是衡量品质的重要指标之一，是消费者关注的重点，肉色主要由肉中肌红蛋白相对质量分数及存在状态决定。贮藏过程中，肉中脱氧肌红蛋白和氧合肌红蛋白逐渐转化成高铁肌红蛋白，生鲜肉逐渐由鲜红色转变为褐色，最终腐败变质[1-3]。因此，检测肌红蛋白相对质量分数对评估生鲜肉品质至关重要。围绕肌红蛋白的检测方法研究，Mancini等[4]采用K/S比率法测定，但其反射衰减比和极限值会导致误差，为此，Krzywicki[5]提出应用可见光分光光度计测量473、525、572、730 nm处的入射光投射衰减，以此计算肌红蛋白的比例，该方法目前已成为肌红蛋白测定的标准方法，但测定过程中需要制备样品，无法满足肉制品生产及销售过程中实时在线检测的需求[6-7]。

光谱无损检测无需前处理和制备样品，可实现肉制品的无损、即时、在线检测。该方法已开始应用于猪肉、牛肉等食品的品质检测研究[8-9]，其中光谱数据预处理及预测模型是实现光谱无损检测的关键[10-11]。李伟等[12]利用全谱段光谱数据借助移动窗口平滑、一阶差分求导和矢量归一化预处理方法，建立线性偏最小二乘拟合模型，模型预测准确率可达93.39%。姜沛宏等[13]应用非线性神经网络建立牛肉新鲜度分级模型，克服了线性模型的局限性，模型预测准确率达98.31%。Wang等[14]研究发现选用全谱段光谱信息预测生鲜肉水分含量，光谱数据存在冗余信息。为减少冗余信息，Chen等[15]应用连续投影算法和深度学习堆叠自动编码器算法提取特征光谱，获得的预测模型比基于全波长的预测模型更为准确。

目前研究已基本实现肉制品多项指标的无损检测，但采用光谱无损检测方法检测肉制品中肌红蛋白含量的研究未见报道。文章提出一种采用漫反射可见光谱定量检测生鲜牛肉和猪肉中脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白和高铁肌红蛋白相对质量分数的无损检测方法，利用定义的光谱反射吸光度预测生鲜牛肉、猪肉中肌红蛋白相对质量分数，检测过程中无需制样，可实现肌红蛋白的无损检测，以期为生鲜肉制品品质监控提供技术支持。

1 模型构建

根据Krzywicki[16]研究，脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白、高铁肌红蛋白的特征波长分别为545、565、572 nm，且3种肌红蛋白在525 nm均有特征峰。525 nm处3种肌红蛋白的消光系数相等，因此选定525 nm为基准波长。定义肌红蛋白特征波长处的表面漫反射率倒数的对数为反射吸光度，见式(1)。

(1)

式(1)中，Ai为反射吸光度；Ri为反射率，%；i=525、545、565、572。

将特征波长的反射吸光度、基准波长的反射吸光度的比值作为自变量，构建肌红蛋白相对质量分数多元线性回归方程，见式(2)。

(2)

式(2)中，poxy为氧合肌红蛋白的相对质量分数，%；pdeoxy为脱氧肌红蛋白的相对质量分数，%；pmet为高铁肌红蛋白的相对质量分数，%；ak=0、1、2、3，bk=0、1、2、3，ck=0、1、2、3，均为模型参数。

2 材料与方法

2.1 实验材料

选取生鲜牛肉和生鲜猪肉黄瓜条部位作为实验对象，生鲜牛肉和猪肉购置于无锡某超市，将购回的整块生鲜牛肉和猪肉黄瓜条上下左右表面切除，从中间部位切取大小尺寸一致(2 cm×2 cm×2 cm)、质量为5 g的小块，放入PP托盘内用保鲜膜缠绕封口，将样品随机分为实验组和验证组各3组，放入4 ℃恒温恒湿箱中分别贮藏6 d，每天分别测定实验组和验证组内的6个平行样，共36个样品，每个平行样测定6个点，共测定216个实验点。

PP托盘购置于无锡某超市，长宽高分别为18.5 cm×12 cm×2.5 cm，为减少托盘颜色对肉样漫反射影响，研究采用的PP托盘为黑色。

保鲜膜采用市场上普遍使用的PE缠绕型保鲜膜，样品贮藏时用保鲜膜封口。

2.2 仪器与设备

2.2.1光谱检测系统构成

PG2000-Pro-EX型光纤光谱仪，上海复享光学股份有限公司(信噪比450∶1，分辨率1.67 nm，积分时间10 ms～120 s，波段195～1 125 nm，波长间隔0.44 nm)；Morpho通用光谱仪控制软件、STD-WS型标准白板，上海复享光学股份有限公司；数据收集器；反射支架(304不锈钢)，实验室自制；EOS 80D型数码单镜头反光相机，日本佳能公司；Spectra Light QC型标准多光源灯箱，美国X-rite公司。

2.2.2光谱检测系统连接

将光纤光谱仪、反射支架、盛有生鲜牛肉与猪肉的黑色托盘放于标准多光源灯箱中，黑色托盘放于反射支架上(防止光纤支架阴影对光谱采集的影响)，检测中标准多光源灯箱用黑色织物遮盖防止环境光线对测定的影响，数据收集器在光纤输出端采集光谱数据，数码单镜头反光相机拍摄样品形貌。光谱检测系统连接方式如图1。

1-标准多光源灯箱；2-光源；3-反射支架；4-实验样品；5-光纤检测端；6-石英光纤；7-反射光谱测量支架；8-光纤光谱仪；9-三脚架；10-数码单镜头反光相机；11-黑色织物；12-数据连接线；13-数据收集器；14-实验台。图1 光谱检测系统Fig.1 Spectral detection system

2.3 实验方法

2.3.1漫反射光谱采集

1)设置D65光源(光源强度3 000 a·u、环境温度25 ℃、光纤光谱仪信噪比450∶1)。

2)实验样品(表面温度为4 ℃)放置在黑色托盘中，放于反射支架上，关闭室内灯光待测。

3)采集光谱，拍摄样品形貌(光圈5.6，快门1/125 s，ISO 200)，每块样品测定6个点，6次平均值作为样品反射光谱。反射光谱每天采集1次，直到肉表面呈现浅绿色伴有黏液，散发刺激性气味时停止光谱采集，实验结束。生鲜牛肉和猪肉的实验时间均为6 d。

2.3.2可见分光光度计测定肌红蛋白相对质量分数

研究参照Krzywicki[5]实验方法测定肌红蛋白相对质量分数。

1)取5 g待测样品，加入25 mL浓度为0.04 mol/L，pH值6.8的磷酸钠缓冲溶液。

图2 生鲜牛肉光谱分析Fig.2 Analysis of spectrum of fresh beef

2)将加入磷酸钠缓冲溶液的样品在室温下用匀浆器均质30 s，置匀浆后的均质液于4 ℃恒温恒湿箱中保存1 h。

3)均质液于4 ℃恒温恒湿箱取出，放入转速为4 500 r/min的离心机中离心20 min。

4)将上清液通过滤纸过滤，用可见分光光度计测定滤液吸光度。

3 结果与分析

3.1 光谱分析

生鲜牛肉和猪肉于4 ℃恒温恒湿箱中分别贮藏6 d，贮藏过程中生鲜牛肉和猪肉光纤光谱仪反射光谱、可见分光光度计光谱如图2、图3。由光纤光谱仪采集到的光谱与可见分光光度计采集到的光谱相比，生鲜牛肉和猪肉在545、565 nm处存在显著吸收峰或反射峰。此外，随贮藏时间增加，特征峰峰值呈现反射率降低、升高、降低的3个阶段变化规律，反映了不同肌红蛋白在贮藏期内的相互转变。

3.2 肌红蛋白相对质量分数变化

生鲜牛肉和猪肉于4 ℃恒温恒湿箱中分别贮藏6 d，贮藏过程中生鲜牛肉、猪肉颜色变化如图4、图5。结果表明：随时间推移，生鲜牛肉和猪肉的颜色由暗红色变为鲜红色，最终呈现褐色。肌红蛋白中铁离子的化合价态(Fe2+或Fe3+)与氧气结合的位置是导致其色泽变化的根本原因。图6为采用可见分光光度计测量的贮藏过程中生鲜牛肉和猪肉中脱氧肌红蛋白、氧合肌红蛋白、高铁肌红蛋白分别在总肌红蛋白中的质量分数变化。

图3 生鲜猪肉光谱分析Fig.3 Analysis of spectrum of fresh pork

图4 生鲜牛肉颜色变化Fig.4 Color change of fresh beef

图6 生鲜肉3种肌红蛋白相对质量分数变化Fig.6 Changes of relative mass fraction of myoglobin in fresh meat

整个贮藏过程中，反射光谱、生鲜肉颜色、肌红蛋白相对质量分数三者变化相互关联[17-18]，生鲜牛肉和猪肉均在0～1 d、2～3 d、4～5 d呈现阶段性变化，因此，将生鲜牛肉和猪肉指标变化分为3个阶段。

第1阶段，肌红蛋白依靠电子传递链使铁离子处于还原状态，3种肌红蛋白相互转化，脱氧肌红蛋白相对质量分数基本不变；脱氧肌红蛋白转化成氧合肌红蛋白的速率与脱氧肌红蛋白转化成高铁肌红蛋白的速率一致，生鲜牛肉、猪肉呈现暗红色，反射率降低。

第2阶段，肉与空气中的氧气充分接触，肌肉中二价铁离子被氧化为三价铁离子，脱氧肌红蛋白相对质量分数基本不变，脱氧肌红蛋白转化成氧合肌红蛋白的速率高于脱氧肌红蛋白转化成高铁肌红蛋白的速率，生鲜牛肉、猪肉呈现鲜红色，反射率升高。

第3阶段，生鲜牛肉和猪肉脱氧肌红蛋白相对质量分数基本不变。生鲜牛肉氧合肌红蛋白的相对质量分数呈下降趋势变化，4 d后急剧下降；高铁肌红蛋白的相对质量分数呈上升趋势变化，第4天时高铁肌红蛋白转化成脱氧肌红蛋白的能力消失，高铁肌红蛋白相对质量分数急剧上升，生鲜牛肉开始腐败变质，呈现褐色，反射率降低。生鲜猪肉氧合肌红蛋白相对质量分数呈下降趋势变化，高铁肌红蛋白相对质量分数呈上升趋势变化，第5天时高铁肌红蛋白相对质量分数急剧上升，生鲜猪肉开始腐败变质，反射率降低。

3.3 模型验证

为验证本研究建立的预测模型，将光纤光谱仪测得的光谱反射率[图2(a)、图3(a)]代入式(2)构建回归分析模型，经回归分析所得模型参数见表1。

表1 肌红蛋白多元线性回归方程模型Tab.1 Multiple linear regression equation model parameters of myoglobin

实验值与模型预测值如图6。为进一步评价模型精度，将实验值与模型预测值进行线性回归，R2值与拟合曲线见图7、图8，拟合方程的截距均小于10-14，斜率等于1，说明本研究提出的基于漫反射可见光谱肌红蛋白无损检测方法能预测生鲜牛肉和猪肉中3种肌红蛋白相对质量分数。

图7 生鲜牛肉肌红蛋白预测Fig.7 Prediction chart of myoglobin in fresh beef

图8 生鲜猪肉肌红蛋白预测Fig.8 Prediction chart of myoglobin in fresh pork

4 结 论

基于表面漫反射可见光谱，提出了定量检测生鲜牛肉和猪肉3种肌红蛋白相对质量分数的方法，预测生鲜牛肉和猪肉3种肌红蛋白质量分数，判定生鲜牛肉和猪肉的品质。检测过程中无需制样，对生鲜牛肉和猪肉无破坏，适用于实时在线检测，证明了无损检测3种肌红蛋白预测模型在食品品质预测方面的可行性，旨在为生鲜肉流通中品质检测提供基础。