胶体金免疫层析技术在猪病毒病诊断中的应用与研究进展

肖璐，谢晶，曹冶，叶勇刚，于吉锋，廖党金，林毅，李兴玉，魏勇，叶健强，潘梦，康润敏

(四川省畜牧科学研究院动物遗传育种四川省重点实验室,四川 成都 610066)

胶体金(colloidal gold)又叫金溶胶，是氯金酸在还原剂的作用下形成一种带有负电荷的稳定的疏水金颗粒悬液，胶体金颗粒能够对多种生物高分子物质进行吸附结合，且这种结合不会影响其生物特性，是免疫反应的理想标记物。胶体金标记技术以胶体金颗粒为核心，将其作为示踪标志物，是一种新型免疫标记技术。胶体金检测技术主要包括：斑点免疫金渗滤法(dot immunogold filtration assay, DIGFA)和胶体金免疫层析法(immunochromatographic test strip, ICST)，目前在猪病诊断、检测领域中使用最为广泛的当属ICST。

1 研究背景及原理

在1857年，英国学者采用还原法从氯金酸水溶液中成功地制备出了胶体金，并发现了其能发生颜色变化，这一发现对胶体金技术发展具有重要的意义。上世纪60年代Feldherr等提出以胶体金作为电子显微镜的示踪标志物；70年代，Faulk等首次建立了基于胶体金的检测技术，开创了该技术在免疫分析领域应用的先河；80年代末至90年代初，Spielberg等研究学者为了检测抗HIV的斑点免疫金渗滤试验从而最早地建立了DIGFA，Beggs等建立了一种更加简便快速的免疫学检测技术，即ICST，最早用于人尿和血清中HCG的检测。此后，胶体金作为一种新型免疫标记技术得到很快发展。

ICST以硝酸纤维素膜为载体，利用毛细管作用将已知的特异性抗原或抗体固定于膜上作为检测带；将胶体金标记物置于玻璃纤维的结合释放垫上干燥，一端与膜相连，另一端与样品垫相连，当加入液体待测品后，样品通过样品垫毛细管的扩散作用向前移动，随后通过含标记物的玻璃纤维，使标记物重新水化，并与胶体金标记物相互反应，然后一起向前泳动至检测线，阳性反应时，会出现直观的红线，阴性反应则不见颜色变化。

2 胶体金技术在猪病诊断中的应用

2.1 在猪病毒性腹泻诊断中的应用

猪腹泻病是现代规模集约化养猪场的一种最为常见的多因素性疾病，在猪的疾病中出现腹泻症状的占30%40%，仔猪腹泻发病率更高，给养猪业造成重大经济损失。引起猪腹泻性疾病的病毒主要以猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、A型猪轮状病毒(porcine rotavirus group A)为主。胶体金检测技术简单快速、高效灵敏、检测结果直观且明显，尤其适合猪场或基层检测猪腹泻病毒。李嘉琛[1]将胶体金颗粒标记TGEV的N蛋白单克隆抗体，以羊抗小鼠IgG和单克隆抗体N蛋白分别作为质控线和检测线，建立了TGEV ICST技术检测方法，其检测灵敏度可达1.02.0TCID50/0.1 mL。汪怿旸等[2]基于单克隆抗体 mAb-C11建立了一种基于胶体金技术的PEDV快速检测方法，最低检测限度可达310个TCID50病毒量。刘兆磊等[3]在硝酸纤维素膜上喷加纯化的抗猪轮状病毒VP6蛋白多克隆抗体和羊抗鼠IgG，建立了猪轮状病毒ICST检测方法，该方法最低可检出1∶32稀释的病毒培养液(TCID50为10-6.25/0.1 mL)。Li等[4]也选择了N蛋白，建立了PEDV ICST技术，与商业试剂盒检测结果相比，此方法能在10 min内完成检测，其灵敏度、特异性分别可达96.0%、90.8%。Lyoo等[5]建立的PEDV ICST技术，其检测限度可达104.0TCID50/mL，与RT-PCR检测技术相比，所建立方法对粪便样品的检测灵敏度和特异性分别达到95%和98.6%。

2.2 在猪圆环病毒病诊断中的应用

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)主要引起猪多系统功能障碍类疾病，同时，PCV2会侵害免疫系统，造成猪的免疫抑制，引发其他继发感染，导致猪群死亡。此病在世界各国普遍存在、蔓延，给全球的养猪业造成了较大威胁和经济损失。时建立等[6]将胶体金颗粒标记PCV2 Cap蛋白和兔IgG，包被至玻璃纤维膜上制备金标垫，再将抗原和羊抗兔IgG分别包被至检测线与质控线上，建立了检测PCV2 ICST检测方法并组装检测卡，与常规PCV2 ELISA商品化试剂盒的检测符合率高于95%。张禹等[7]基于G蛋白，以PCV2病毒颗粒和兔IgG分别作检测线与质控线组装成胶体金试纸条，样品检测结果显示与ELISA总符合率达到98%，贾蕊[8]选择Cap蛋白，组建了可在5 min内完成检测的PCV2 ICST检测试剂盒，其检测灵敏度为1∶25 600，该试纸条可室温储存6个月，274份血清样品检测结果与ELISA商品试剂盒的总符合率为98.17%。Jin等[9]选择PCV2的Cap蛋白，组建了PCV2 ICST技术，500份临床血清样品检测结果与商业化ELISA试剂盒的符合率达到94%，所建立技术特异性良好，检测效率较高。

2.3 在猪口蹄疫诊断中的应用

口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)感染偶蹄类动物而引发的一种急性、热性、高度接触性传染病，FMDV有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3及Asia1型，口蹄疫流行广、传播快、发病率高，曾多次在世界范围内发生大流行，对畜牧业造成严重的威胁。 朱玉婵等[10]采用胶体金为标记物制备了快速定量检测Asia1型FMDV ICST检测方法，拟合检测曲线，用金标分析仪实现了定量检测，该方法特异性强、敏感性高，15 min内可完成检测，最低检出限度达到0.78 μg/mL。孙燕燕等[11]将胶体金颗粒与口蹄疫 A型疫苗株 146S 病毒粒子结合，作为金标抗原，与其抗体分别作为检测带与质控带，组装A型FMDV ICST检测试纸条，该试纸条特异、灵敏、稳定性高，最低检测抗体效价达到1∶128。Yang等[12]建立了O型FMDV ICST技术，可在5 min内完成检测，其检测灵敏度可达95% (38/40)，且与其他病毒抗体无交叉反应，与ELISA商品试剂盒的检测效率相当。 Kanatbek等[13]首先表达了FMDV的特异性重组蛋白2C、3A、3B及3D，分别基于此4种蛋白建立了FMDV ICST检测技术，基于所建立的技术和商业化试剂盒同时对100份健康未免疫牛血清样品、25份阳性牛血清样品、90份健康经免疫血清进行检测，结果发现其符合率均超过90%，且基于2C的ICST检测效果最佳，但总体而言仍有5%～9%的假阳性率。

2.4 在猪繁殖与呼吸综合征诊断中的应用

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的猪的一种传染性极高的繁殖障碍与呼吸系统传染病，以免疫抑制为特征，入侵机体后可破坏免疫系统，造成严重免疫抑制和混合感染，其暴发与流行给我国养猪业带来了巨大的经济损失，危害严重。吴斌等[14]基于胶体金技术，以PRRSV多克隆抗体，HP-PRRSV单克隆抗体及羊抗鼠IgG二抗分别作为检测线和质控线，建立了PRRSV抗ICST检测技术，其最低检测限度为100 TCID50，60份临床样品检测结果与PRRSV RT-PCR诊断试剂盒检测结果的符合率达到91%。Yu等[15]也基于N蛋白，建立了PRRSV ICST技术，用所建立方法对来自韩国71家猪场的991份经检测的、已知PRRSV阴阳性的血清样品进行检测，结果显示该方法的灵敏度达97.5%，其特异性达91.1%，此结果与PRRSV ELISA商品试剂盒的结果接近。Li等[16]选择了PRRSV的NSP7蛋白，构建了PRRSV的胶体金检测方法，1 034份血清样品检测结果显示，胶体金免疫层析与2种不同的ELISA商业试剂盒的总体符合率分别达到91.7%、88.9%，由此说明ICST技术在PRRSV的快速诊断中具有一定的优势。

2.5 在猪瘟诊断中的应用

猪瘟(classical swine fever, CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)引起的一种高度接触性烈性传染病，猪感染后表现为高热稽留，全身多发性出血、母猪繁殖障碍等，该病被OIE列为种类法定通报的动物传染病之一，我国农业部也将其列为“一类动物疫病”。王泽洲等[17]以纯化的猪瘟病毒(CSFV)重组E2蛋白和纯化全病毒为抗原，用镧系元素铕为荧光标记，建立了检测猪瘟抗体的镧系荧光ICST快检试剂盒，该试剂盒特异性强，稳定准确，其批内和批间变异系数分别小于5%和10%。王向鹏等[18]基于CSFV E2蛋白的单克隆抗体，组装了CSFV ICST检测试纸条，其最低检测限度可达到103.5TCID50，且与常见的猪病毒无交叉反应，可区分CSFV的野毒株和弱毒株。Ren等[19]同样基于保守的E2蛋白，建立了CSFV ICST检测方法，与商业化试剂盒的检测结果一致性超过93%。Li等[20]选择CnC2 蛋白，建立了CSFV ICST检测技术，通过对各血清型CSFV菌株的敏感性测试可知，检测结果的敏感性达到97%(65/67)，检测特异性达到100%(98/98)，结果与现有的商品化试剂盒一致，相关系数达到0.935。

2.6 在猪伪狂犬病诊断中的应用

猪伪狂犬病(pesudorabies, PR)由猪伪狂犬病毒(pesudorabies virus, PRV)引起多种家畜、野生动物的一种以发热、脑脊髓炎为主的急性传染病。PRV一旦进入猪群，其净化难度较大，危害难以根除。李曦等[21]以PRV gE蛋白和兔抗鼠IgG分别作为T线和C线，组装了PRV ICST试剂条，184份样品的检测结果显示，与PRV gE ELISA商品检测试剂盒的检测结果相比较，该组装试纸条检测的特异性为81.6%，敏感度为90.7%。雷有玲等[22]基于重组gE蛋白和猪IgG分别作为检测线和质控线，组装了检测PRV ICST检测试纸条，其与商品化试剂盒检测结果的符合率高于95%，可稳定保存6个月，检测PRV野毒阳性血清的灵敏度可达1∶1 280。邱荣超等[23]以胶体金标记了gB蛋白作为探针，建立了PRV ICST快速检测试纸条，其敏感性与商品化试剂盒符合率可以达到91.04%。Shen等[24]研发了一种PRV荧光免疫层析检测试纸条(F-ICS)，最低检测限度为0.13 ng/mL，检测线范围(DLR)为0.13～2.132 ng/mL，最低检测线比普通的试纸条还低10倍，在临床应用中发现，此技术与PCR的检测结果一致。Li等[20]也选择糖蛋白gB作为胶体金标记，把葡萄糖球菌蛋白A和gB抗体分别接种于鲜花纤维膜上组装了胶体金试剂盒，结果显示条带的特异性为98.1%，与对照抗PRV血清的敏感性为96.0%，296份血清样品检测结果显示与商业化试剂盒相比一致性达到93.6%。

2.7 在其他猪病毒病诊断中的应用

此外，ICST技术在猪乙型脑炎、非洲猪瘟、猪流感等常见猪病诊断中也有报道[25-29]。其中，乙型脑炎病毒胶体金免疫层析检测技术能明显区别阴阳性血清，其灵敏度与特异性分别可达到84.8%、97.7%。组装的非洲猪瘟病毒胶体金免疫层析试剂盒能检测到的重组蛋白最低浓度可达45 ng/mL。目前针对猪流感病毒的胶体金免疫层析技术涉及H1N1、H3及H1N1、H3二联胶体金，其检测效率高，特异性强。

3 胶体金免疫层析技术的优点与瓶颈

胶体金作为示踪标记物在基础研究和检验检疫中应用十分广泛，ICST与PCR、荧光定量PCR(qPCR)、ELISA、病原分离鉴定等常见病毒检测技术相比，其优势十分明显(表1)。首先，快捷简便，结果直观。ICST检测试纸条体积小、便携且操作快速简便，5 min内可根据颜色变化判读结果，而PCR结果还需借助凝胶电泳和紫外凝胶成像系统，qPCR需通过荧光定量PCR仪读取数据，ELISA则需要酶标读数仪读取吸光度，PCR、qPCR和ELISA检测耗时在3 ～4 h，而病原分离鉴定的检测则周期更长。第二，安全。ICST安全无污染，而另外3种检测技术中均可能接触有害试剂，安全性均不及ICST。第三，成本低。ICST检测完全不需要特殊或昂贵仪器设备，也不需专业技术人员，检测成本低廉。因此ICST简单、快速、成本低廉，更适用于现场和基层直接检测应用，适合批量检测和筛查，普适性强。第四，不需样品处理。ICST检测时，不需要对样品进行前处理，而PCR、qPCR需要提取样品核酸，ELISA需要高速离心后分离样品血清，病原分离鉴定则需要对样品进行研磨或破碎处理。

表1 几种常见检测方法的比较

ICST是动物疫病快速诊断领域的一个重要的发展方向，优势突出，但也存在一些发展瓶颈。首先，通过颜色进行结果判读，只能作为定性检测，无法实现定量或半定量检测，且在组织样品检测时ICST并不适用；其次，采用ICST检测时，一次检测仅能获得一个样品的单一对应结果，还未实现多重检测，且目前看来ICST的多重检测存在一定的技术难度，在多重或混合靶标的筛查中发展受限；第三，与PCR、qPCR或ELISA相比，ICST灵敏度和特异性仍有待提升，尤其是粪便等样品检测中，当病毒含量较低时，检出率不如分子学及免疫学检测技术，因此ICST更适合普筛，不能满足标准或高要求的检测需求。

4 小结与展望

随着现代养猪业的发展，密集型、集约化的饲养模式稳步发展，伴随日益发达的猪群的跨区域流通贸易，无形之间增加了猪群间的接触几率，从而加速了疾病的传播概率，猪群多疾病混合感染的日益渐增，引发猪群死亡，造成巨大的损失。PRV、CSFV、乙型脑炎病毒(JEV)、PCV2、PRRSV、FMDV及猪细小病毒(PPV)等是猪群中主要的重要猪病毒性病原，常常混合感染，目前，兽医实验室诊断常用技术仍以核酸检测或血清检测为主，但是该方法均耗时长、操作过程复杂、检测成本高且对检测人员有一定的技术要求，因此与ICST相比，其普适性较低。ICST作为一种新的免疫学方法，有着检测快速、价格低廉、操作简单、携带方便、安全无污染等特点，在动物检验检疫中有着广泛的应用前景，但其准确性及灵敏性仍有待提升，以期获得更准确的检测结果，其检测范围也有待扩大，以便适用于更广泛的检测范围。总体而言，胶体金免疫层析技术的出现及推广可极大地降低临床、基层及偏远落后地区的病原检测难度，有其重要的应用必要性和不可取代性，对实现我国动物检疫工作的科学化、标准化和快捷化具有重要意义。