高通量测序技术在兽医临床中的应用

伍钢，韦佳塔，张玉雪，陈海兰，刘琪琦，江明生*

(1. 广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005；2. 军事医学研究院辐射医学研究所，北京 100850)

高通量测序(high-throughput sequencing, HTS)又称“下一代”测序技术(next generation sequencing, NGS)，是2005年以后逐步推出的一系列新测序方法的统称。它先从样本中制备DNA文库，然后采用PCR方法扩增连接接头后的文库并利用磁珠进行纯化，再对磁珠纯化后的文库进行大规模并行测序[1]。由Roche公司开发的焦磷酸测序系统是市场上第一个商业化的HTS测序平台，然后相继出现了Illumina公司的Solexa平台、Thermo Fisher公司的Ion Torrent平台。

自从推出了第一个HTS平台以后，测序数据质量和产量呈指数级增长，使得DNA测序在技术上更简单、更快速、更便宜，大大加快了基因组研究的进度，使其在流行病学研究、病原检测、疾病诊断、药物靶点发现等领域的应用得以快速推广[2-5]。

虽然HTS技术已发展得相当成熟，但其在兽医领域的研究和应用相对较少。本文就近年来HTS在兽医临床中的应用进行综述，并对其在兽医领域的发展趋势进行展望，旨在帮助兽医研究和工作者更快的了解HTS技术，利用这个强大的技术解决兽医领域的问题，促进畜牧兽医行业的健康快速发展。

1 高通量测序技术发展现状

DNA序列的测定是分子生物学研究中一项非常重要和关键的内容，基因的分离与定位、基因的结构与功能、基因的表达与调控、基因与疾病的关系、药物作用靶点等研究都依赖于对DNA一级结构的详细了解。自1977年Sanger测序问世以后，测序技术取得了巨大的发展，从第一代的化学降解法、双脱氧链终止法、荧光自动测序技术和杂交测序技术，经过了第二代的Solexa测序技术、SOLiD测序技术和454测序技术，最终进入以单分子测序为特点的第三代测序时代[6]。测序读长由长至短再到长，测序速度不断提升，测序成本则显著下降[7]。

1977年，Sanger采用化学降解法测定了噬菌体X174全长5 375个碱基的序列，开启了基因组学时代[8]。2001年，美、英、法、德、日和中国6个国家采用Sanger发明的双脱氧链终止法联合完成了首个人类基因组图谱的绘制，为人类揭开自身奥秘奠定了坚实的基础。第一代测序是以传统的链终止法和化学降解法为原理的DNA测序法，它的读长可达1 000 bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高、通量低、操作复杂和对有毒或放射性试剂的依赖，严重限制了它的大规模应用[9]。随着人类基因组计划的完成，人们进入了后基因组时代(功能基因组时代)。为了克服Sanger测序法的不足，研究者们不断地对测序技术进行开发和改进，以寻求Sanger测序法的替代者，随之诞生了以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa和Hiseq技术为代表的第二代测序技术[10]。HTS高通量的显著特性使其在保持高度准确性的同时极大地加快了测序进程，使核酸测序的成本明显降低，满足了越来越多对时间和资源要求都很苛刻的大型基因组测序项目的需求[1]。近二三年，出现了无需进行PCR扩增的单分子测序技术，被称为第三代测序技术，以Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技术和PacBio公司的SMRT为代表。

HTS技术的快速发展，给生命科学的研究带来了极大的便利，被广泛应用于新物种(亚型)发现、基因表达分析、非编码小分子RNA鉴定、转录因子靶基因筛选、DNA-蛋白质相互作用等领域，对揭示生命本质的研究起到了关键的作用[11]。该技术同样被越来越多地应用于动物品种改良指导、畜禽疾病诊断、分子流行学研究、致病机理探索、耐药性分析等畜牧兽医的相关研究[12]。

2 高通量测序技术在兽医临床上的应用

畜牧养殖业是关乎国民经济发展的重要支柱产业之一，HTS是在生命科学领域强势崛起的新型技术，在畜禽疾病诊断、疾病监测、致病机理探索、耐药性分析等领域逐渐展现其应用优势，表现出巨大的应用前景。

2.1 高通量测序技术在畜禽疾病诊断中的应用

动物传染病是由病原微生物引起的一种具有传染性的疫病，近年来，我国动物疫病呈现多发状态，且多呈混合感染。例如，2018年暴发的非洲猪瘟(African swine fever，ASF)在短短几个月内迅速扩散至全国，截至2019年7月底，全国31个省份暴发ASF疫情150起，其中家猪暴发146起，野猪暴发4起[13]。对病原体的快速、全面、准确鉴定，是及时制定有效的防控措施、减少疾病传播和损失的关键。基于单一目标的传统检测方法耗时长且操作复杂，难以满足动物传染性疾病复杂、传播快的特征，而采用HTS的宏基因组测序技术克服了多数病原体不能培养的限制，可准确高效地获得病原体全部的遗传信息，从而直接快速鉴定出病原。2016年冬季，阿拉斯加州内陆地区暴发的犬细小病毒(CPV)引起犬类发病率和死亡率明显增加[14]。Parker等[14]通过对12只疑似感染犬细小病毒的犬的12个直肠拭子标本提取的靶向转录RNA进行高通量测序，发现发病率和死亡率的增加原因不是由于新型病毒的出现，而是由于未接种疫苗或疫苗接种剂量过低。基于HTS的全基因组比对分析在2014—2015年欧洲零星暴发的禽流感病毒H5N8的诊断中发挥了重要作用，Bouwstra等[15]对来自荷兰的高致病性禽流感病毒进行了遗传分析，并与欧洲、韩国和日本的毒株进行了比较，数据显示病毒的传播宿主可能是来自亚洲的候鸟。

遗传性疾病也是严重威胁动物养殖健康发展的因素之一，HTS技术可通过基因组测序和比较基因组学分析，快速鉴定引起疾病的突变位点，改善对动物遗传缺陷的管理和控制。为了追求更高的生产性能，优良品种动物被大量推广和使用，但该策略通常会引起遗传缺陷的定期暴发。Sartelet等[16]采用全基因组关联研究和HTS技术快速发现了引起比利时蓝牛遗传性关节病的31个候选点突变，其中 PIGH基因第一个内含子(c 211-10C>G)中的一个C到G转换，预计会影响到它的受体剪接位点，转录翻译产生的PIGH 蛋白缺乏必要的结构域，从而不具有生物学活性，这是引起比利时蓝牛关节病的关键。

2.2 高通量测序技术在疾病监测中的应用

随着畜禽养殖的集约化和规模化发展，畜禽养殖出现“老病不断、新病频发”的现象。应用分子生物学理论与技术，从分子基因水平研究病因和流行因素，是国家、地方相关部门和企业主制定防控措施的依据。HTS技术可在微量条件下完成对临床样本中遗传物质的扩增和分析，而不需要对病原体进行分离培养，不需要设计目的序列的针对性引物，不依赖病原体遗传背景[17]，在分子流行病学中HTS技术可以作为发现未知病原、识别和跟踪传播途径等疾病监测的重要工具[18]。

相比于传统的耗时长的未知病原的鉴定方法，如病毒分离培养、血清学分析、免疫电镜观察等，HTS技术不依赖于病原体遗传背景和高通量的特点使其具有非常大的优势。Tang等[19]使用HTS技术对宾夕法尼亚州患有病毒性关节炎的肉鸡中分离出的禽呼肠孤病毒(ARV)进行全基因组测序，发现了与常见田间毒株不同的2个新毒株，包括野外变异种(Reo/PA/Broiler/15511/13或 PA15511)和(Reo/PA/Turkey/22342/13)。Andriyan等[20]使用HTS对2006—2007年间收集的美国感染西尼罗病毒(West Nile Virus, WNV)的禽类样品DNA进行测序，鉴定出含有13个核苷酸缺失的新遗传变异体。Chen等[21]利用RNA-Seq在对国内家禽进行的一项调查的过程中意外发现了一种新的冠状病毒。2003年荷兰暴发的H7N7高致病性禽流感导致近3 000万鸡被捕杀、89人感染、1人死亡，调查人员采用Illumina深度测序对样品进行分析，发现高致病性禽流感病毒(H7N7)感染人后， PB2 E627K基因的突变频率明显增加[22]。

病原物种、亚型、分离株和变异株的多样性使它们在毒力、预防接种、流行病学、诊断和治疗等方面有着重要影响。HTS技术在研究病原体的遗传多样性与致病性之间的关系有着独特的优势，例如通过获取猪繁殖与吸吸障碍综合征病毒(PRRSV)的完整基因组序列，或通过比较该病毒ORF5序列，可判断暴发毒株的来源、传播途径和持续存在的原因[23]。Guyard-Nicodème[24]与Ohishi等[25]都采用HTS分析了人源性和鸡源性空肠弯曲杆菌的分子流行病学特征，通过比较基因组学分析一致认为食用被空肠弯曲杆菌污染的鸡肉是其传染给人的主要传播途径。

2.3 高通量测序技术在致病机理研究中的应用

病原微生物感染宿主后，与宿主机体免疫系统之间的博弈通常会导致自身基因组部分位点发生变异，从而使其逃逸宿主免疫系统对它的攻击和清除，从而得以生存。此外，在药物治疗过程中，病原也可能通过基因突变改变药物作用靶点结构，或产生灭活酶或钝化酶，或改变代谢途径等手段来逃避药物的作用，产生对该类药物的耐药性。HTS测序通过覆盖靶基因位点数十倍甚至上百倍的深度测序，有效地展现病原微生物基因组发生的变化，揭示其致病机制，指导临床防治。

临床试验和生产实践中发现，相比于其他的禽白血病病毒(ALV)，ALV-J亚型更具致病性，但原因不明[26]。Meng等[27]因此采用HTS技术对ALV和ALV-J的基因组进行分析，发现ALV-J与人类免疫缺陷病毒相似，具有很高的基因重组率，更容易发生突变，从而表现出广泛的遗传多样性[28]。宁蓬勃[7]采用HTS技术对猪瘟病毒石门株感染与未感染的SUVEC基因在转录水平的表达差异的研究发现，猪瘟病毒石门株可能利用改变宿主细胞复制周期、抗凋亡、抗炎症等多种策略实现自身的复制增殖，并逃避宿主免疫系统的清除。Barbosa等[29]采用HTS技术对澳大利亚考拉及考拉身上蜱虫中的锥虫群落进行患病率和遗传多样性研究，在考拉中第一次发现了Trypanosomanoyesi的感染，同时还发现了1个新的锥虫种感染，此外得到了考拉中锥虫感染多为2种以上甚至多达5种锥虫的复合感染，为澳大利亚考拉锥虫病的治疗提供了依据。对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF蛋白与宿主细胞调控相关功能的鉴定，有助于更好地了解断奶仔猪多系统衰竭综合征的发病机制。在PCV2基因组中发现了1个新的PCV2 ORF蛋白，即ORF5蛋白，但其在PCV2感染宿主的发病机制中的作用尚不清楚[30]。Choi等[30]使用RNA-seq技术研究PCV2 ORF5在PCV2感染猪上皮细胞中的作用，发现PCV2 ORF5可能通过抑制涉及Ⅰ型IFN合成的基因的转录从而抑制Ⅰ型干扰素(IFN)的表达，从而增强猪上皮细胞中PCV2的复制，指出PCV2 ORF5蛋白可能对宿主免疫监测具有抑制作用。Bujold等[31]对6种不同类别的13株放线杆菌进行了比较基因组学分析，找出放线杆菌属成员间的异同，识别放线杆菌属某些成员侵袭机制中的决定因素，指出自转运蛋白、唾液酸生物合成/代谢蛋白、IgA蛋白酶1可能与放线杆菌的侵袭性有关。Zysset-Burri等[32]利用HTS对致病性的福氏纳格里阿米巴原虫和非致病性纳格里原虫分别进行全基因组和转录组测序，再结合蛋白质组学技术分析这2种原虫基因组的相似性和表达蛋白的差异性，确定了22个在人类原发性阿米巴脑膜炎致病机制中发挥作用的蛋白，并通过这些蛋白的功能注释提出了细胞膜可能是这些原虫发挥其致病潜能的主要场所的观点。

2.4 高通量测序技术在病原耐药性研究中的应用

抗生素的耐药性问题已成为全世界共同面对的难题之一，据估计到2050年，全球每年将有1 000万人死于细菌耐药，超过目前每年死于癌症的820万人，直接造成的经济损失将会达到约100万亿[33]。动物养殖出现越来越多难以控制和治疗的感染性疾病，每年造成巨大经济损失。HTS技术通过对病原微生物全基因组的高通量测序，可快速获取耐药基因、转座子序列和耐药菌进化轨迹等信息，对研究耐药性的遗传变化规律和耐药机制具有重大意义[34]。铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素最常见的耐药机制是合成SPM-1金属β-内酰胺酶，Nascimento等[35]通过高通量测序技术对6株产SPM-1金属β-内酰胺酶铜绿假单胞菌ST277进行测序，测序后与标准菌株基因组进行比对，一共检测到 26个基因组岛，从中发现了一些参与铜绿假单胞菌耐药过程相关的基因，并且还发现单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)导致抗菌药物耐药性和毒力相关基因的氨基酸变化，为继续深入研究铜绿假单胞菌的耐药机制奠定了基础。

通过高通量测序不仅可以快速鉴定出耐药基因，还可以确定耐药性产生的机制[36]。Binh等[37]采用HTS技术就对3种克拉霉素敏感及耐药的幽门螺杆菌的基因组DNA进行了测序，发现高抗药性致病菌内含有23S rRNA基因的A2143G点突变，同时发现了与克拉霉素抗药性有关的2个新突变位点infB和rpl22。使用HTS技术对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的研究发现，移动遗传元件SCCmec可以携带mecA基因进入对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌内，使其获得对甲氧西林的耐药特性[38]。朱阵[36]采用高通量测序技术测定的福氏志贺菌基因序列与de novo 序列比对，发现metG、gyrB、gydA、rob、narX等多个基因序列及其他的间区均存在突变位点，其中甲硫氨酰tRNA合成酶metG和酞酰脯氨酰顺反异构酶ppiA的基因位点突变与福氏志贺菌的耐药性有关，同时还发现该菌种环丙沙星药物的作用靶点gyrB基因。孔令聪[39]利用高通量测序技术发现单个碱基突变的gyrA基因即可导致牛A型多杀性巴氏杆菌菌株对喹诺酮类药物产生耐药性，高度耐药时gyrA基因第83位，parC第80、84位碱基同时发生点突变，这些突变抑制了药物与细菌表面药物作用靶位的结合；而牛A型多杀性巴氏杆菌23S rRNA第2 059位的碱基置换则引起菌株对大环内酯类药物的耐药。

3 前景与展望

HTS技术革新了基因组研究的格局，测序深度和分辨率的提高使基因组的探究达到了更高的层次，加深了对人类、动物和病原体基因组复杂性与动物传染病的进化、传播方式和致病性的理解[40]。自改革开放以来，我国的畜牧业总产值一直处于上升态势，2017年超过3.2万亿，占农业总产值比例的30%，带动上下游相关产业产值3万亿元以上。但畜牧业具有集中化、规模化的特点，容易引起病原体大规模的传播和感染。

目前兽医临床上主要采用药敏试验、PCR等分子生物学手段对畜禽病原体耐药菌株进行鉴定，根据鉴定结果强化病原体耐药性监测，减少细菌耐药性的产生和蔓延，制定防控措施[41]。但是，药敏试验需要经过细菌分离培养才能检测到临床样本里的耐药菌株，其周期较长，培养条件受限制的菌株不能进行药敏试验[42]。多重PCR技术可直接检测培养物或临床样本的耐药基因，但是基于PCR的耐药基因检测方法只能检测已知耐药基因且检测通量有限[43]。而可对大量核酸进行无差异序列测定的高通量测序技术则有很大优势，不但可以快速检测出多种致病病原体，还可有效发现未知病原，不需要培养菌株就可检测在单个样本中同时存在的多个不同的病原体和耐药基因[21,44]，对于细菌耐药性临床监测、疾病诊断、流行病学研究及指导防控措施的制定都有着重要意义。此外，高通量测序结合生物信息学分析对病原体基因组遗传特征的研究，可帮助科研人员预测和筛选合适的病毒抗原表位，确定可用于疫苗开发的基因序列[40,45]。HTS技术与转录组学、蛋白组学的结合可以在基因表达、转录、翻译3个阶段对致病基因位点突变的精确鉴定，可有效指导致病机理的分析，药物作用靶点的确定和新药的设计与开发，为后期动物传染病的预防和治疗奠定理论基础[45]。

与常规的分子生物学检测手段相比，HTS拥有比较大的优势。但HTS运行设备及试剂耗材的高昂价格，后期数据分析要求的丰富生物信息学经验，以及HTS研究方法的标准与序列数据生成、分析、注释和报告流程规范的缺失和不完善，极大地限制了HTS在兽医临床的广泛应用[45-47]。因此，为了充分发挥HTS在畜禽疾病防治、疾病监测、致病机理探索、耐药性控制、药物开发等领域中的作用，需要研制成本更低的设备，开发价格更低的配套试剂和耗材，同时提高用户友好性和诊断实验室的可访问性，使非专业用户更方便对测序结果进行分析[11]。目前测序程序在大型临床实验室和公共卫生实验室正在朝自动化的方向发展，标准化数据处理和分析也正在开发中，未来需要将测序和数据分析整合到一个有效的工作流程中，实现在兽医临床中HTS使用的全自动化[8]。在将来用户只需要将细菌培养物/样本加载到测序仪的DNA制备模块中，无需人工交互，直接生成针对每个实验室需求定制的标准化报告并将其存储在实验室信息管理系统(LIMS)数据库中，提供实时的疾病监测数据，及时制定有效防控措施[19]。

无可置疑，HTS已经给兽医临床工作带来了巨大的变革。相信随着成本的降低和技术的改进，HTS技术在兽医临床中势必会成为必不可少的诊断工具并发挥举足轻重的作用，提高疾病诊断和药物研发的效率，促进养殖行业的健康发展。