家禽粪便环境对常用消毒剂灭活H5N6亚型禽流感病毒的影响

秦涛，汪川韦，郑淑媚，张佳琦，朱闽，陈素娟，彭大新

(扬州大学兽医学院/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

在2010年以前，我国主要流行的是H5N1亚型禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)，而2010年之后，家禽中又陆续出现了H5Nx亚型AIV的流行[1-3]。自2013年以来，H5N6亚型高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)已逐渐取代H5N1亚型HPAIV成为目前我国家禽主要流行株[4-5]。另外近年来有感染人的事件发生，严重威胁着公共卫生健康。疫苗接种虽能有效地控制HPAIV，但是在抗体选择压力下，病毒的变异速度加快，导致疫苗的免疫效果失败，因此仅仅依赖疫苗并不是最有效的防控手段[6]。很多学者及从业者逐步认识到养禽场和活禽交易市场的防疫核心仍然是生物安全体系的建设，其中消毒技术体系是最基础但最不容忽视的环节。养禽场和活禽交易市场存栏禽规模较大，产生的粪便体量较大，特别是活禽交易市场，存在环境和器具等清洁不彻底导致粪便残留等问题。H5N6亚型AIV主要通过粪口途径传播，粪便排毒常见，可见如何保障有效杀灭家禽残留粪便中的病毒是阻断传播的关键。但按照常用消毒剂说明书的推荐浓度是否能有效杀灭病毒目前尚不明确。因此，本试验在家禽粪便环境下评估了5种常用的化学消毒剂对我国H5N6亚型HPAIV流行株的灭活效果，为科学合理地选择养禽场和活禽交易市场消毒剂种类和剂量提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与毒株

犬肾细胞(madin-darby canine kidney，MDCK)培养于含10%胎牛血清的DMEM中。A/Goose/Anhui/AHG0419/2016(H5N6)禽流感病毒，由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室动物生物安全三级实验室分离、鉴定并保存。

1.2 主要试剂

5种消毒剂分别为：过硫酸氢钾复合物、二氯异氰脲酸钠、戊二醛癸甲溴铵、癸甲溴铵和戊二醛苯扎溴铵。按照说明书，过硫酸氢钾复合物的推荐浓度：针对AIV的使用浓度为0.062 5%，法氏囊病毒的使用浓度为0.25%，水产养殖的使用浓度为0.5%。疫源地消毒时，二氯异氰脲酸钠的推荐使用浓度为0.2 g/L，戊二醛癸甲溴铵的推荐使用浓度为0.2%～0.1%，癸甲溴铵的推荐使用浓度为0.015%～0.05%，戊二醛苯扎溴铵的推荐使用浓度为1%。所有消毒剂使用的标准硬水(硬度342 mg/L)[7]，由氯化镁(MgCl2·6H2O，0.139 g)和氯化钙(CaCl2，0.034 g)加蒸馏水至1 L配制。

各消毒剂所对应的中和剂[8]：过硫酸氢钾复合物和二氯异氰脲酸钠的中和剂为0.2 mol/L硫代硫酸钠(国药集团)；戊二醛癸甲溴铵的中和剂为0.1%甘氨酸(Biosharp)+0.3%吐温80(BioFRoxx)；癸甲溴铵的中和剂为0.1%甘氨酸+0.3%吐温80+0.03%卵磷脂(国药集团)；戊二醛苯扎溴铵的中和剂为0.05%甘氨酸+0.4%吐温80。

1.3 中和剂鉴定试验

1.3.1 中和剂及中和产物对H5N6亚型AIV在MDCK细胞中增殖的影响

依据卫生部颁布的《消毒技术规范》[7]，评估粪便、中和剂及中和产物对病毒滴度的影响。试验共分为9组：第1组是消毒剂+病毒悬液；第2组是(消毒剂+病毒悬液)+中和剂；第3组是中和产物(消毒剂+中和剂)+病毒悬液；第4组是(硬水+病毒悬液)+中和剂；第5组是(硬水+病毒悬液)+PBS；第6组是(粪便+硬水+病毒悬液)+中和剂；第7组是(粪便+硬水+病毒悬液)+双抗PBS；第8组是(硬水+病毒悬液)+硬水+双抗PBS；第9组是硬水+PBS，作为不接病毒对照组。试验结果评判标准：第1组无试验病毒或有少量病毒；第2组较第1组为病毒稍多或相近数量，但较第3、4、5、6、7和8组显著减少；第3、4、5、6、7和8组病毒数量与原接种量相近，第9组细胞生长正常。每组试验重复3次。

1.3.2 病毒灭活试验

依据卫生部颁布的《消毒技术规范》[7]，用标准硬水将消毒剂配制为双倍浓度，吸取溶液0.5 mL于2个离心管中，置25℃水浴中5 min，再分别吸加0.5 mL病毒悬液(新鲜家禽粪便与尿囊液1∶1混匀后，25 ℃水浴锅中放置30 min)，混匀并放回25℃水浴锅。待作用一定时间(10 min、30 min、60 min)后，立即取出0.1 mL，加入含有双抗的中和剂0.9 mL，混匀，作用30 min后，进行10倍系列稀释(101～108)，接种于MDCK细胞，37℃、5% CO2培养箱中培养，病毒的半数细胞感染剂量(TCID50)按照Reed-Muench法进行计算，平均灭活对数值按下式计算：设阳性(病毒)对照组平均TCID50的为N0，试验(消毒)组平均TCID50为Nx，平均灭活对数值=lgN0-lgNx，当平均灭活对数值=lgN0时，视为病毒完全灭活。试验重复3次。

2 结果

2.1 中和剂及中和产物对病毒滴度的影响

前期研究发现本试验所用的4种中和剂及其中和产物不影响MDCK细胞的生长状况[9]。采用的9组试验方案结果表明，含0.4 mol/L的硫代硫酸钠双抗PBS可以有效中和1%过硫酸氢钾复合物溶液以及3.2 g/L二氯异氰脲酸钠溶液；含0.6%吐温80+0.06%卵磷脂+0.2%甘氨酸的双抗PBS可以有效中和 0.24%癸甲溴铵溶液；含0.6%吐温80+0.2%甘氨酸的双抗PBS可以有效中和2%戊二醛癸甲溴铵溶液；含0.8%吐温80+0.1%甘氨酸的双抗PBS可以有效中和0.8%戊二醛苯扎溴铵溶液；与病毒阳性对照组对比，加入中和剂及中和产物后，对病毒的滴度影响较小(见表1)。

表1 中和剂及中和产物对病毒滴度(TCID50)的影响 lg

2.2 粪便环境对过硫酸氢钾复合物杀灭H5N6亚型AIV的影响

在无粪便环境下(对照组)，0.2%过硫酸氢钾复合物溶液作用10 min可以将H5N6亚型AIV完全杀灭(灭活对数值为5.17±0.17)；在粪便环境下，该消毒剂需提高2.5倍用量，0.5%作用10 min才能将病毒完全杀灭(灭活对数值为5.42±0.09)(见表2)。

表2 在不同环境下过硫酸氢钾复合物溶液对H5N6亚型AIV的灭活效果 lg

2.3 粪便环境对二氯异氰脲酸钠杀灭H5N6亚型AIV的影响

在无粪便环境下，浓度为0.4 g/L二氯异氰脲酸钠溶液作用10 min可以将H5N6亚型AIV完全杀灭(灭活对数值为5.50±0.00)；在粪便环境下，该消毒剂需提高2倍用量，0.8 g/L浓度作用10 min才能将病毒完全杀灭(灭活对数值为5.25±0.25)(见表3)。

表3 在不同环境下二氯异氰脲酸钠溶液对H5N6亚型AIV的灭活效果 lg

2.4 粪便环境对戊二醛癸甲溴铵杀灭H5N6亚型AIV的影响

在无粪便环境下，0.25%戊二醛癸甲溴铵溶液作用10 min可以将H5N6亚型AIV完全杀灭(灭活对数值为4.75±0.25)；在粪便环境下，该消毒剂需提高4倍用量，1%作用延长至30 min才能将病毒完全杀灭(灭活对数值为4.67±0.00)(见表4)。

表4 在不同环境下戊二醛癸甲溴铵溶液对H5N6亚型AIV的灭活效果 lg

2.5 粪便环境对癸甲溴铵杀灭H5N6亚型AIV的影响

在无粪便环境下，0.015%癸甲溴铵溶液作用10 min可以将H5N6亚型AIV完全杀灭(灭活对数值为5.17±0.25)；在粪便环境下，该消毒剂需提高8倍用量，0.12%作用延长至30 min才能将病毒完全杀灭(灭活对数值为5.13±0.24)(见表5)。

表5 在不同环境下癸甲溴铵溶液对H5N6亚型AIV的灭活效果 lg

2.6 粪便环境对戊二醛苯扎溴铵杀灭H5N6亚型AIV的影响

在无粪便环境下，0.1%戊二醛苯扎溴铵溶液作用10 min可以将H5N6亚型AIV完全杀灭(灭活对数值为5.09±0.42)；在粪便环境下，该消毒剂需提高4倍用量，0.4%浓度作用10 min才能将病毒完全杀灭(灭活对数值为5.25±0.25)(见表6)。

表6 在不同环境下戊二醛苯扎溴铵溶液对H5N6亚型AIV的灭活效果 lg

3 讨论

本研究选择了5种养殖场常用的消毒剂，评估在粪便环境下对各种消毒剂杀灭目前流行的H5N6亚型HPAIV的影响。结果表明，这5种消毒剂均受到家禽粪便环境的影响。与无粪便环境对比，杀灭粪便中H5N6亚型HPAIV，过硫酸氢钾复合物溶液作用浓度需提高2.5倍，二氯异氰脲酸钠溶液作用浓度需提高2倍，戊二醛癸甲溴铵溶液作用浓度需提高4倍，癸甲溴铵溶液作用浓度需提高8倍，戊二醛苯扎溴铵溶液作用浓度需提高4倍。相较而言，过硫酸氢钾复合物溶液、二氯异氰脲酸钠溶液受粪便的影响较小；戊二醛癸甲溴铵溶液与戊二醛苯扎溴铵溶液受粪便的影响较大，癸甲溴铵溶液受粪便的影响最大。与各消毒剂最大推荐浓度相比，过硫酸氢钾复合物溶液、二氯异氰脲酸钠溶液、戊二醛苯扎溴铵溶液在粪便环境下均可以有效灭活H5N6亚型HPAIV，而癸甲溴铵溶液、戊二醛癸甲溴铵溶液在粪便环境下均不能有效灭活H5N6亚型HPAIV，使用时需提高至最大推荐浓度以上。银涛等[10]在对戊二酸消毒剂灭菌效果研究发现，通过添加有机物来影响消毒剂消毒效果，随着消毒剂浓度的降低，有机物影响效果越明显。粪便可以吸附并且中和消毒剂，阻碍了与病毒的直接接触，从而显著降低了消毒剂的活性，影响消毒效果。因此对于粪便残留物的消毒，应选用穿透力和氧化性强的消毒剂，例如二氯异氰脲酸钠溶液等。