猪源乳酸杆菌的安全性及抗逆性评价

张桢，朱晓峰，崔雷鸿，虞德夫，杭苏琴

(南京农业大学国家动物消化道营养国际联合研究中心/江苏省消化道营养与动物健康重点实验室/消化道微生物研究室，江苏 南京 210095)

近年来，抗生素滥用导致细菌耐药性问题日益严峻，随着我国颁布的禁抗令开始执行，寻找可靠、安全无副作用的抗生素替代品成为养殖行业的当务之急。益生菌通过定植在宿主胃肠道内，改变宿主肠道内菌群组成，并通过调节宿主黏膜与系统免疫功能，促进宿主对营养成分的吸收，维持动物机体健康[1]。李宗凯等[2]研究表明，益生菌可显著提高育肥猪生长期平均日增重，降低料重比。梅文晴等[3]研究表明，早期饲喂复合益生菌对肉仔鸡盲肠内容物中细菌多样性无显著影响，但可升高某些有益菌的定植丰度；上调小肠上皮组织中紧密连接相关基因的表达，促进绒毛的生长，从而潜在地影响肉鸡早期和后期的生长性能。益生菌已成为养殖业中广受关注的一类饲料添加剂。

乳酸菌是一类通过利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌统称。乳酸菌大量定植可使肠道pH值下降，造成偏酸的肠道环境，导致致病菌难以生存，从而实现保护肠道微生物稳态和增强机体免疫功能的效果[4]。然而一些研究结果表明，乳酸菌也能够从败血症[5]和肝脓肿[6]患者体内分离出，这增加了人们对益生菌安全性问题的关注。因此，在益生菌用于生产前其安全性必须得到重视和检测。益生菌从食入到定植需要一定时间，且只有在胃以及肠道内具有较高的存活率才能发挥作用，因此对益生菌进行模拟胃肠道消化试验，检测其对模拟胃肠道的耐受性。

本试验对分离自某猪场不同生理阶段猪结肠、盲肠黏膜、食糜处的3株乳酸杆菌，通过溶血性试验及有害代谢产物检测其安全性，通过抗生素敏感试验对其抗逆性以及对模拟肠道耐受能力进行探讨，为其在生产中应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株

3株乳酸杆菌罗伊乳杆菌(L.reuteri)L45(简称L45)，植物乳杆菌(L.plantarum)L47(简称L47)和约氏乳杆菌(L.johnsonii)(简称L63)由本实验室自行分离自江苏某猪场不同生理阶段(仔猪、生长肥育猪、母猪)肠黏膜和食糜[7]。菌株用MRS培养基(青岛海博生物有限公司)于37 ℃活化培养24 h，3 000 r/min离心10 min，重悬于无菌生理盐水中备用。化脓链球菌(Streptococcuspyogenes)ATCC 19615购自美国菌种保藏中心。

1.2 生长特性检测

通过对活化的乳酸杆菌在37 ℃培养箱中培养24 h的生长曲线、活菌数、pH值和乳酸产量进行测定，对冻存于-20 ℃的3株猪源乳酸杆菌以及按照3株乳酸杆菌1∶1∶1比例复配菌株(简称MIX)的存活情况、生长特性进行检测。将活化的乳酸杆菌按1% 的接种量接种于MRS 培养基，接种后每2 h进行取样[8]，测定发酵液的吸光值(OD600值),以培养时间为横坐标、吸光值为纵坐标绘制3株菌的生长曲线。

1.3 安全性试验

在无菌条件下，将活化后的3株乳酸杆菌菌液分别在含5%羊血的血琼脂平板(百思一基生物有限公司)上划线涂布， 37 ℃培养48 h，观察是否有溶血圈出现[9]。化脓链球菌ATCC 19615为阳性对照菌。

在无菌条件下，将活化后的菌液按3%的接种量接入到蛋白胨水培养基(青岛海博生物有限公司)中，37 ℃培养48 h，培养结束后滴加Kovacs靛基质试剂2～3滴，观察是否产生吲哚[10]。培养基颜色变为红色为阳性，黄色为阴性。

在无菌条件下，将活化后的3株菌株按3%的接种量分别接入Taylor氏脱羧酶试验培养基(赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸，青岛海博生物有限公司)，37 ℃培养72 h，滴加溴甲酚紫，观察是否产生硝酸还原酶。培养基颜色由黄色变紫色为阳性，不变色为阴性。

在无菌条件下，将活化后的3株菌株按3%的接种量分别接入到硝酸盐培养基(青岛海博生物有限公司)中37 ℃培养5 d后，滴加碘化钾溶液和淀粉溶液各10 滴，观察是否产生氨基酸脱羧酶[11]。若变红，则为阳性；若不变色，继续加入少量锌粉，如仍不变红则也为阳性，如变红则为阴性。

1.4 抗生素敏感性试验

采用纸片扩散法测定菌株的抗生素敏感性试验。取稀释后的菌液(100 μL)均匀的涂布于90 mm的MRS琼脂培养基表面，使用无菌镊子将含抗生素(氧氟沙星、阿莫西林、环丙沙星、诺氟沙星、红霉素、链霉素和氨苄西林)的药敏纸片(杭州微生物试剂有限公司)放置于平板表面，37 ℃培养24 h后对抑菌圈直径进行测定[12]，根据美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)[13]制定的标准，将敏感性分为耐药、中度敏感或敏感。

1.5 模拟胃肠道耐受性试验

人工胃液：在pH值为2.5的无菌生理盐水中加入3.0 g/L胃蛋白酶，充分溶解后，用无菌微孔滤膜(0.22 μm)过滤除菌，得到人工胃液，37 ℃备用。人工肠液：在pH值为8.0的无菌生理盐水中，加入1.0 g/L胆盐，充分溶解后，过滤除菌，37 ℃备用。将活化的菌液按10%的接种量接入上述人工胃液中，于37 ℃培养4 h；接入人工肠液中培养20 h。采用平板涂布法对菌液进行活菌计数，按照以下公式计算存活率[14]：

1.6 数据统计与分析

试验数据通过SPSS 24.0统计软件中的单因素(One-way ANOVA)模型分析，Tukey S-B test比较差异显著性，P<0.05表示差异显著；图表通过GraphPad prism 8.0.2软件制作，显著性水平为P<0.05。试验数据以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 乳酸杆菌生长特性

如图1所示，植物乳杆菌L47在第24小时OD600值达到0.80，活菌数为8.07lg CFU/mL，显著高于其他2株菌(P<0.05)；植物乳杆菌L47在第24小时pH值为4.01，显著低于罗伊乳杆菌L45的4.50和约氏乳杆菌L63的4.52(P<0.05)；乳酸产量为135.21 mmol/L，显著高于罗伊乳杆菌L45的108.84 mmol/L、约氏乳杆菌L63的106.12 mmol/L以及混合菌的124.49 mmol/L(P<0.05)。

A: 生长曲线；B: 培养24 h的活菌数；C: pH值变化；D: 培养24 h的乳酸产量注：字母相同表示差异不显著(P>0.05)，不同表示差异显著(P<0.05)。下同图1 试验菌株生长特性

2.2 乳酸杆菌安全性

菌株安全性检测结果如表1所示，3株菌的安全性检测均表现阴性，即均未发生溶血现象，未分解色氨酸生成吲哚，未产生硝酸还原酶与氨基酸脱羧酶。

表1 菌株安全性试验结果

2.3 抗生素敏感性试验

如表2所示，3株乳酸杆菌对不同的抗菌药表现出不同的耐受性。罗伊乳杆菌L45对红霉素和链霉素耐药，对阿莫西林敏感，对氧氟沙星、诺氟沙星和氨苄西林表现中介敏感；植物乳杆菌L47除对链霉素耐药外，对其余几种抗生素表现出敏感或中介敏感；约氏乳杆菌L63对所有测试抗生素耐药。

表2 菌株的抗生素敏感性试验结果

2.4 模拟胃肠道耐受性试验

由图2可以看出，3株乳酸杆菌在pH值为2.5的人工胃液分别消化4 h，其存活率均在90%以上，其中植物乳杆菌L47存活率达到了99.11%，显著高于其他2株菌(P<0.05)。在pH值为8.0的人工肠液消化20 h后，约氏乳杆菌L63的存活率显著高于植物乳杆菌L47(P<0.05)，达到65.53%。

图2 菌株在人工模拟胃液(A)和肠液(B)下的存活率

3 讨论

3.1 乳酸杆菌安全性

溶血是指红细胞因水或细菌渗入而膨胀破裂，血红蛋白逸出，进而引发动物贫血，致使动物出现急性器官功能障碍。本试验结果显示，3株乳酸杆菌均未产生α-溶血或β-溶血[15]，说明测试菌株均不是溶血细菌[16]。

吲哚试验可以检测菌株是否会将蛋白质中的色氨酸分解产生吲哚，而色氨酸代谢过程发生障碍会引起肝功能衰退等多种疾病。试验结果表明测试菌株不分解色氨酸产生吲哚，说明不会导致色氨酸出现代谢障碍。硝酸还原酶是一种氧化还原酶，可使硝酸盐转换成亚硝酸盐，导致组织缺氧和机体中毒；氨基酸脱羧酶是通过催化脱去某种氨基酸的羧基从而生成对应的胺的裂解酶的总称，由氨基酸脱羧生成的胺类多数是有毒的物质。本研究结果显示，3株乳酸杆菌代谢产物中均不含硝酸还原酶和氨基酸脱羧酶，因此不会转换动物体内或饮食中的硝酸盐为亚硝酸盐，不会对机体产生有害影响，也不会裂解氨基酸形成胺类等有毒物质使动物中毒[17]。

3.2 乳酸杆菌抗生素敏感性

抗生素通常被用于治疗各种由于细菌感染或致病微生物感染而导致的疾病，然而由于抗生素的滥用，导致越来越多的细菌对抗生素产生了耐药性。有研究表明，耐药细菌的耐药基因在一定条件下可以转移到其他细菌中，因此益生菌在使用于生产前需要对其耐药性进行检测[18]。本试验结果表明试验菌株都具有一定的耐药性，约氏乳杆菌L63对试验中使用的所有抗生素都表现出耐药，植物乳杆菌L47敏感性较好，对除了链霉素以外的6种抗生素均表现出敏感或中介敏感，显著优于罗伊乳杆菌L45和约氏乳杆菌L63，菌株之间表现出了各自复杂的耐药性。徐进等[19]对22株乳酸杆菌进行耐药性检测发现，不同菌株之间的耐药性也存在着巨大差异，因此选择对抗生素敏感性较好的菌株用于生产尤为重要。由上述结果可知，试验菌株中植物乳杆菌L47对常用的抗生素较为敏感，适合用于生产。但其对链霉素的抗性基因是否存在转移的风险，还需进一步从基因角度验证[20]。

3.3 乳酸杆菌模拟胃肠道耐受性

益生菌在定植之前，必须经过胃和小肠的消化转运，只有在经过消化转运之后仍具有较高存活率的益生菌才能顺利定植进而发挥作用。试验结果表明，菌株对模拟胃液的耐受性存在显著差异，植物乳杆菌L47存活率显著高于罗伊乳杆菌L45和约氏乳杆菌L63，有研究表明，胃液pH值会随饮食结构变化而在1.5～3.0之间波动，空腹时胃液pH值会低至1.5，本试验中模拟胃液pH值为2.5，乳酸杆菌存活率有一定降低，因此这提示我们应当避免动物空腹食用乳酸杆菌；菌株对模拟肠液的耐受性结果表明，约氏乳杆菌L63的存活率显著高于植物乳杆菌L47，这与模拟胃液耐受性结果相反，但是由于食用乳酸杆菌后，乳酸杆菌先经过胃消化再经过小肠消化，因此菌株对模拟胃液的耐受性更高更有利。综合考虑，植物乳杆菌L47在模拟胃肠道试验中具有更高的存活率，在真实胃肠道环境中更容易存活进而对机体产生有益作用[21]。

4 结论

通过对3株猪源乳酸杆菌进行生长特性、溶血性、有害代谢产物检测以及模拟胃肠道耐受性试验证实，3株乳酸杆菌均不溶血，不产生硝酸盐还原酶和氨基酸脱羧酶；植物乳杆菌L47生长特性最佳，对抗生素具有较强的敏感性，不易产生耐药性，在模拟肠液中存活率较高。上述特性表明，植物乳杆菌L47具有潜在优良益生菌的特性，这为该株益生菌的开发及应用提供参考依据。