芒柄花素磺酸钠对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

包成, 李铁成

1丹东市第一医院研究生培养基地麻醉科(辽宁丹东 118000) ； 2 锦州医科大学附属第三医院麻醉科(辽宁锦州 121000)

心血管疾病是全球病死率最高的疾病，其中急性心肌梗死(acute myocardial Infarction, AMI)发病极为凶险,后果最为严重[1]。现有的有效治疗手段主要有溶栓术，经皮冠脉介入治疗等临床方法，通过医学手段实现血流再通[2]。但在实现心肌缺血再灌注的同时，部分患者心肌缺血症状反而加重，甚至出现了心肌细胞的大面积坏死的现象，这种现象称为缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury, I/R)，发病机制主要有氧自由基的增加，钙超载，炎症因子的作用及能量代谢障碍等[3-4]。减轻心肌缺血再灌注损伤是一个亟待解决的问题，药物的预处理是近年来的医学研究热点。据研究表明芒柄花素对心血管有一定的保护作用，且有较强的抗炎作用，可以抑制各种炎性因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的释放和表达，可防治以炎症为基础的疾病演变[5]。但由于芒柄花素难溶解于水，而芒柄花素磺酸钠(sodium formononetin-3′-sulfonate，Sul-F)是芒柄花素的磺化产物，在不影响药理作用的前提下大幅度提高了水溶性[6]。因此，2019年6—9月，本研究通过构建心肌缺血再灌注SD大鼠模型，观察芒柄花素磺酸钠对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用，从而为心肌缺血的临床治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物 芒柄花素磺酸钠(大连美仑生物技术有限公司，批号：N0922A)。

1.2 动物 SD健康雄性大鼠(锦州医科大学动物实验中心提供)。

1.3 试剂 髓过氧化酶(MPO)试剂盒(南京建成生物公司)，TNF-α试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)，IL-1β试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)，肌酸激酶(CK-MB)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)。

1.4 仪器 小动物呼吸机(成都泰盟软件有限公司)，心电监护仪(北京迈瑞医疗)，酶标仪(美国Molecular Devices 公司)。

1.5 实验方法 选择健康雄性SD大鼠32只，每只体重范围240～300 g,随机分成4组，每组8只，分别为假手术组、缺血再灌注模型组(模型组)、芒柄花素磺酸钠高剂量组(高剂量组)、芒柄花素磺酸钠低剂量组(低剂量组)。大鼠称重分组后，术前12 h禁食，可正常饮水。前5 d给予不同剂量芒柄花素磺酸钠的预处理，低剂量组20 mg/kg，高剂量组40 mg/kg。假手术组和模型组给予等量生理盐水安慰剂。其中假手术组，冠状动脉左前降支下穿线，不结扎，其余3组均给予结扎30 min，再灌注120 min。

1.5.1 造模方法 将大鼠用20%的乌拉坦溶液腹腔注射麻醉后，固定于实验操作台，气管插管后固定行机械通气。吸气与呼气的比约为1∶2，潮气量30 mL/kg。提起表皮于四肢皮下轻刺入针形电极，监测并记录大鼠Ⅱ导联心电图。选取胸骨左缘3～4肋间处作一切口，开胸并暴露心脏，用无创缝合线穿过左冠状动脉前降支的下方约2 mm处，位于左心耳与肺圆锥动脉之间，再将缝线穿过自制的套管，系紧缝线阻断血流30 min左右，再剪短绳结给予再灌注120 min。以监测系统心电图的ST段抬高幅度≥0.15～0.2为结扎成功标准，而再灌注后ST段回落幅度超过50%为再灌注成功标志[7]。

1.5.2 指标检测方法 以上各组于再灌注末期取血，滴入离心管，将离心管放置于离心机中，设置转速3 000 r/min，离心10 min，取血清。用比色法测定MPO的活性,用酶联免疫吸附法(ELISA法)测定CK-MB、TNF-α和IL-1β的活性,以上各项操作严格按照试剂盒说明书来执行。剪掉心脏，将心尖放置于甲醛溶液中冷藏保存，心肌组织放置于-80℃的深冻冰箱中保存。组织切片做HE染色，于光学显微镜下观察心肌组织的病理变化。

2 结果

2.1 各组心律失常的发生率 与假手术组比较，各组均有心律失常的发生，而高剂量组、低剂量组的室性心律失常的发生率远小于模型组，高剂量组的作用强于低剂量组。见表1。

表1 各组大鼠心律失常的发生率

2.2 芒柄花素磺酸钠对I/R大鼠心肌损伤程度的影响 在HE染色后，可以明显见到假手术组细胞形态结构无异常，而模型组大量细胞核溶解，固缩，部分细胞核碎裂，肌纤维紊乱，且伴有大量炎性细胞浸润。高剂量组、低剂量组处理后的心肌损伤有明显改善，细胞损伤较轻，少量炎性细胞浸润。见图1。

2.3 芒柄花素磺酸钠对I/R大鼠血清中CK-MB、MPO、TNF-α及IL-1β活性的影响 (1)TNF-α的含量，模型组远高于假手术组(P<0.001)、低剂量组(P<0.001)和高剂量组(P<0.001)，且高剂量组优于低剂量组(P<0.05)。(2)IL-1β的含量,低剂量组与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)，但假手术组<高剂量组<低剂量组<模型组，高剂量组与低剂量组差异有统计学意义(P<0.05)。(3)大鼠心肌损伤后MPO的含量大幅度增加，经过芒柄花素磺酸钠20、40 mg/kg处理后，各组MPO含量有所减少，呈剂量-效应关系。(4)与模型组相比，给药后的各组CK-MB的释放明显减少(P<0.01)。见表2。

注：A:假手术组；B:模型组;C:低剂量组;D:高剂量组；于400倍视野下观察，给药组大鼠心肌损伤程度明显减轻，高剂量组优于低剂量组

表2 芒柄花素磺酸钠对心肌缺血再灌注大鼠血清中各项生化指标的影响

3 讨论

药物的干预是近年来心肌缺血再灌注损伤的一个研究热点，而炎症因子在心肌缺血再灌注损伤的发病机制中占有重要地位。MPO代表着中性粒细胞的活化程度，通过调节细胞信号通路诱导炎症相关基因的表达，因此MPO可以预测心肌损伤的严重程度[8-9]。Calmarza等[10]研究显示 MPO水平的变化与急性冠脉综合征明显正相关(P<0.001)，MPO于再灌注早期就有所表达，表达程度可能与心肌梗死面积相关，主要功能是形成具有氧化作用的自由基，造成心肌损伤。同样当心肌损伤时，大量的心肌酶如CK-MB会释放入血，血液中的酶含量急剧升高，心肌损伤则进一步加重。本实验中模型组大鼠血清中MPO、CK-MB的含量远高于其他三组，说明了芒柄花素磺酸钠对心肌有一定的保护作用。

TNF-α和IL-1β于再灌注早期发挥了重要作用[11]。在炎症反应的过程中由于中性粒细胞的大量聚集导致血管堵塞再灌注效果不理想，同时会释放出大量的TNF-α和IL-1β[12-13]。TNF-α可以诱导细胞凋亡，并且与内皮细胞结合产生的过氧化物阴离子通过刺激髓过氧化物酶产生更多的炎性因子，从而加重炎症反应。IL-1β由单核巨噬细胞分泌，持续升高会加重心肌损伤，且IL-1β与TNF-α有协同作用[13]。本实验研究发现芒柄花素磺酸钠可以抑制TNF-α和IL-1β的过度表达，可见芒柄花素磺酸钠对心肌缺血再灌注时损伤的保护作用可能与抑制炎症反应有关，其具体机制有待进一步探讨。