标本存放时间及温度对刺激法Th1/Th2胞内细胞因子检测的影响*

苗竹林, 钟兴明, 崔蓉, 李佩佩, 王永霞, 钟文瑶, 赵文忠

广东省计划生育专科医院、广东省计划生育科学技术研究所国家卫生和计划生育委员会男性生殖与遗传重点实验室(广东广州 510600)

流式细胞检测技术对免疫细胞可进行有关物理、化学特性的多参数测量，是目前临床检验的重要手段。Th1/Th2细胞及其产生细胞因子与疾病的发生发展关系密切[1]，但目前没有广泛用于临床，其原因之一为一些医院需要外送，标本检测的及时性可能对检测结果造成一定的影响，上述问题一直困扰着临床和检验工作者。流式细胞技术分析标本的运送与保存是医学检验分析前质量控制的重要内容，特别是对一些淋巴细胞及其产生细胞因子的检测，此类检测项目步骤繁琐，影响因素多，对标本采集、运送、检测时间等都有特别要求，需要注意质量控制。而刺激法检测细胞因子，要求在细胞存活时间内进行刺激检测，因此，有必要对标本不同存放时间及温度对检测外周血胞内细胞因子Th1/Th2检验结果的影响进行分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2012年1月至2019年6月期间在我院门诊孕前检查与正常体检女性，无内分泌功能紊乱，无自身免疫性及其他免疫功能紊乱性疾病，随机选取20例,年龄21～40岁，平均31岁。

1.2 Th1/Th2细胞因子检测所用试剂及检测步骤 分别在抽血当天(第1天)、第2天、第3天进行流式细胞检验。流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司生产，型号FACS Calibur，荧光单克隆抗体均购自美国BD公司，佛波酯 (Phorbolmyfismteacetate，PMA)，离子霉素(ionomycin，Ion)，蛋白转运阻滞剂(Brefeldin A，BFA)、裂解液及破膜剂购自(Beyotime公司) ；RPMI1640(GIBCO公司)，上述试剂均4℃避光保存。对外周血标本摇匀后分为两管，一管室温放置，另外一管4℃冰箱放置。(1)全血标本：取150 μL全血标本于试管中，用RPMI1640(不含小牛血清-FBS) 1∶1等体积稀释；(2)加入8 μL 1 μg/mL PMA工作液+8 μL 50 μg/mL Ionomycin工作液+8 μL 0.5 mg/mL BFA工作液，混匀； (3)细胞培养于37℃，5% CO2培养箱3～4 h(不能超过6 h)；(4)从培养箱取出混匀，加入10 μL CD3 PerCP和2 μL CD8 APC，室温，避光孵育15 min；(5)每管中加入1 mL溶血素，室温，避光孵育15 min后加入2 mL PBS，1 200 r/min离心5 min，弃除上清；(6)每管中加入破膜剂1 mL，摇匀，室温避光放置5 min；(7)每管中加入2 mL PBS，1 200 r/min离心5 min，弃除上清；(8)各管中加入相应的γ干扰素(IFN-γ)/白细胞介素(IL)-4抗体7～10 μL(A1：同型对照；A2：IFN-g FITC/IL-4 PE)；(9)室温，避光孵育20 min。每管中加入2 mL PBS，1 200 r/min离心5 min，弃除上清；(10)0.35 mL PBS重悬细胞，上机检测。并进行数据分析。

1.3 统计学方法 使用SPSS 13.0统计软件，组间比较采用两独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 经过PMA+Ion刺激后，Th1/Th2细胞流式细胞技术检测结果 细胞经过刺激之后，流式细胞术检测中首先以物理参数区分淋巴细胞群并设门，进一步收集CD4+/IFN-γ+为Th1细胞，CD4+/IL-4+为Th2细胞，进行分析，见图1。

2.2 常温及4℃冰箱放置下标本不同保存时间Th1、Th2值变化比较 结果显示在室温放置标本，抽血后前3 d检验结果 差异无统计学意义(P>0.05)；3 d后，细胞因子表达量急剧减少，与抽血当天比较差异有统计学意义(P<0.05)。在4℃冰箱放置标本，抽血后前3 d之内检验结果差异无统计学意义(P>0.05)；3 d后，细胞因子表达量急剧减少，与抽血当天比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。而不同温度保存，在同一时间检测 差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 Th1(CD4+/IFN-γ+)和Th2细胞(CD4+/IL-4+)流式细胞图

表1 不同温度及不同保存时间对Th1、Th2变化比较

3 讨论

3.2 流式细胞采用刺激法检测Th1、Th2及Th1/Th2机制及方法 由免疫细胞和一些非免疫细胞经过刺激而合成、分泌的细胞因子是一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，通过与相应受体结合进一步调控免疫反应。检测细胞因子可以间接反映免疫细胞的功能及活动状态[6]。Th2细胞分化主要的经典信号通路是由白细胞介素-4(IL-4)来起始的，IL-4 主要由活化的Th2 细胞分泌的免疫调节细胞因子，可以促进 T淋巴细胞、B淋巴细胞以及肥大细胞的活化增殖，增加巨噬细胞的杀伤功能， IL-4 可抑制促炎细胞因子，拮抗其他促炎过程， 抑制新生血管形成，减少免疫过程引起的细胞损伤[7]。IFN-γ 主要来源于T淋巴细胞和NK细胞，是 Th1 细胞因子反应的经典组成部分，能活化产生分泌炎症细胞因子的 M1型巨噬细胞或小胶质细胞和B淋巴细胞[8]。因此，同时标记细胞内细胞因子IFN-γ和IL-4，可区分Th1细胞(CD4+/IFN-γ+)和Th2细胞(CD4+/IL-4+)[9]。

因为静止的淋巴细胞和记忆T细胞所产生的特异性的免疫应答仅分泌少量细胞因子，因此，必须采用T细胞活化刺激剂诱导细胞分泌大量的细胞因子，以利于提高流式细胞检测率，之后进行全血孵育、高尔基转运抑制剂的固定，细胞裂解，破膜后抗体标记，才能够通过流式细胞技术检测并进行分析[10]。

近年来，淋巴细胞检测的价值引起临床医生的重视，开展此项目的医院也越来越多，而多数实验室人员专注于分析阶段的质量保证，而分析前阶段的质量环节还存在许多问题，上机检测的频率，标本存放的温度以及时间等对Th1与Th2都有一定的影响。

3.3 流式细胞检测Th1、Th2影响因素分析 患者标本采集、保存等分析前检验标本质量是目前影响流式细胞检验质量以及检验结果的最大不确定因素。流式细胞检验技术对样本的保存及上机时间都较为严格，进行流式细胞检验的标本，无论哪一种抗凝剂，一般都可以在室温(16～25℃)保存，但是不同的检验项目保存的时间长短是不同的。检验样本要新鲜采集，不能发生凝血。样本最好应在采集后立刻进行处理，并进行免疫荧光染色和固定，标记好细胞后使用标准溶血剂使红细胞充分溶解，制备好细胞悬液后应尽快上机检测。

但是在临床实践过程中，因为抽血时间，仪器使用及人员的安排等条件限制，很难做到及时检验，标本放置时间延长，尤其是经过了长时间运输和储存的样本死细胞数量增多，死细胞对许多抗体均有很强的非特异性染色，影响检验结果。为了合理利用各种资源，同时保证检验的准确性。有必要了解存放时间和存放温度对检验结果的影响。

本研究结果提示标本室温放置72 h或4℃冰箱内放置72 h，检测结果相对稳定，但超过72 h之后，随着放置时间的延长，结果呈下降趋势，放置时间越长，下降幅度越大。

同时刺激法流式细胞检测胞内细胞因子操作复杂，影响因素较多，存在以下几个方面的问题，激活剂可导致部分表面分子表达下调；细胞破膜过程可影响抗体与细胞表面和细胞内分子的特异性结合；染色破膜的细胞为死亡的细胞, 难以再进行后续的功能实验；仪器设备、人员素质、试剂来源等诸多因素造成不同批次的试剂，不同的操作人员的标准化问题也对实验结果有较大的影响[11]。因此，当Th1与Th2由产生的细胞因子来判断对疾病的诊断价值时，每批实验样本的检验，各个实验室需要进行质量控制。临床在判断Th1、Th2两个亚群时，在检测方法上的一致性至关重要。