纳米粒子与肺泡表面磷脂膜相互作用的力学机理研究1)

焦凤轩 桑建兵 刘朝阳 李 洋

(河北工业大学机械工程学院，天津300401)

目前纳米颗粒(nanoparticles，NPs)已广泛地应用于纳米医学、药物传递、疾病检测和生物传感等领域[1]。虽然NPs具有推动新技术的潜力，但先前的研究也表明了它们对人类健康的潜在风险。其中一个健康风险是空气中NPs的摄取[2]，NPs与肺部的相互作用可以改变呼吸过程中肺部成分的正常特性。空气中颗粒物被吸入的概率主要由颗粒物的大小决定，小颗粒物(如直径小于100 nm的颗粒物)更容易被吸入肺部深处，穿透上皮细胞进入血流[3]。经常吸入空气中的NPs会增加肺部老化的可能性，导致肺部功能障碍，并可诱发严重的肺部疾病，如哮喘、肺癌、急性呼吸窘迫综合征等。吸入的NPs与肺表面活性物质单层(pulmonary surfactant，PS)相互作用，可能对肺表面活性物质层造成严重损伤。此外，在实验研究中发现，吸入的NPs可能与表面活性成分相互作用，抑制肺功能正常，诱发肺部疾病[4]。因此，需要进行分子水平的研究，以探索吸入NPs引起的PS的结构变化，并帮助追踪这些NPs对常见肺部活动的不良影响。

PS主要由磷脂(饱和和不饱和)、胆固醇和少量蛋白质组成，它们共同在肺泡内的气-水界面形成稳定的单层[5]。大约一半的脂质由饱和脂质(DPPC)组成，这是一种饱和的磷脂，在生理温度下可以紧紧地包裹在单分子层中，使PS单分子层能够在压缩[6]时达到0左右的表面张力而不会塌缩。其他的表面活性剂脂质，包括不饱和脂质(POPG)能使单分子层流体化。呼吸过程中，肺泡表面积不断扩大和压缩，PS在空气与水界面达到20～25 mN/m的平衡表面张力[7]。

实验研究和计算研究[8]提供了关于PS单分子层的各种生物物理现象的信息，如相行为变化、表面张力、表面压力、单位脂质面积 (area-per-lipid，APL)、PS组分密度等。越来越多的基于分子动力学模拟的研究发现，当APL从0.49～0.55 nm2降至0.46～0.47 nm2时，气水界面的PS单分子层由液态冷凝相(liquid condensed，LC)和液态膨胀相(liquid expansion，LE)[9]共存变为液态冷凝(LC)相。同样，单层膜的表面张力与APL[10]成正比，在吸入时达到平衡值约23 mN/m，呼气时约降至0。PS的主要成分DPPC在大约41摄氏度时经历了从液态膨胀相和液态冷凝相(LE+LC)共存到LC相的相变。在生理温度下，PS中存在的不饱和脂肪的相变温度通常比饱和脂肪的相变温度低，因此处于LE相。

1 材料和方法

本文使用的金纳米粒子对应的粗粒化类型为C1(如图 1)，肺表面活性剂膜的粗粒化模型使用DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)，POPG(1-棕榈酰基-2-油酰基磷酸酰甘油)和 CHOL(胆固醇)3种脂质分子混合组成。粗粒化 DPPC分子由 12个粗粒子组成，包括一个亲水性的头基 (NC3，PO4)，甘油酯 (GL1，GL2)和两条疏水性的尾链 (C1A-C2AC3A-C4A，CAB-C2B-C3B-C4B)。粗粒化 POPG 分子由 12个 CG粒子组成，包括一个亲水性的头基(GL0，PO4)，甘油酯 (GL1，GL2)和两条疏水性的尾链 (C1A-D2A-C3A-C4A，CAB-C2B-C3B-C4B)，其中一条尾链上有一个碳碳双键。CHOL分子由8个粗粒子组成，包括一个亲水性的头基 (ROH)，一个固醇环体(R1-R2-R3-R4-R5)和一个疏水性的尾部(C1-C2)。水分子W、钠离子NA+和氯离子CL－均由一个粗粒子表示，初始的单层膜的模型如图2所示。

图1 四种不同形状的金纳米粒子

图2 表面活性剂膜及其组成部分的粗粒化模型

本文使用 insasne.py脚本构建初始双层膜模型[11]，SP-B蛋白质使用 martini.py脚本进行粗粒化，DPPC：POPG：CHOL的摩尔比为7:3:1，每一层有1023个脂质分子，然后通过旋转和平移得到两个单层膜。膜平面平行于系统的xy平面，膜法线方向为体系的z轴方向，两个单层膜之间相距大约21 nm，一个25 nm×25 nm×21 nm的水盒被放置在两个单层之间，水盒中大约有 100000个粗粒化的水粒子，然后在水盒中加入浓度为0.15 mol/L的NaCl，这与生理盐水的浓度近似，由于POPG分子的头基带负电荷，因此用同样数量的粗粒化钠离子来取代水粒子，从而使整个系统呈电中性，在水盒存在时，脂质的极性头基朝向水相，然后将整个体系放置在一个25 nm×25 nm×60 nm的盒子中，此时盒子中存在大约34 nm厚的真空，最后将金纳米粒子放置在单层膜上方小于1 nm的位置处。

在健康的人体中肺表面活性剂膜表面张力保持在20～25 mN/m的范围内，称为平衡表面张力。在呼气时肺泡表面压缩，表面活性剂膜的表面张力减小到0。本文构建了两种具有不同初始表面张力的单层体系，分别为0和23 mN/m，对应APL为0.48 nm2和 0.55 nm2，代表了人在呼吸时肺表面活性剂膜的收缩相和扩张相。首先脂质单层体系在没有放置金纳米粒子的情况下单独平衡 500 ns。当脂质单层体系平衡后，将金纳米粒子与脂质单层膜放置在一起，在正则系统下运行750 ns的模拟。

本文所有的模拟均使用Gromacs5.0.7[12]软件进行，模拟结果的可视化使用 VMD1.9.3[13]软件进行，本文对体系的所有方向均使用周期性边界条件 (periodic boundary condition，PBC)。范德华相互作用的截断距离设置为 1.2 nm，且该作用在0.9～1.2 nm之间平滑地过渡到0以减少截断噪音。对于库仑力作用，截断距离设置为1.2 nm。在平衡前，首先使用最陡下降算法对体系进行能量最小化。对所有的模拟，均使用蛙跳式(leapfrog)算法积分的牛顿运动方程，积分步长为20 fs，在NVT(恒定粒子数、体积和温度)系统下使用v-rescale方法进行温度耦合，使得体系逐步升温至310 K(接近DPPC分子的相变温度)，耦合常数为1 ps，脂质分子、水和离子、蛋白质、金纳米粒子均独立耦合。在NPT(恒定粒子数、压力和温度)系统下使用表面张力耦合方法进行压力耦合，表面张力分别设置为0和23 mN/m，耦合常数为1 ps，在xy方向压缩系数为5.0×10－7MPa－1，在z方向将压力控制为0。

2 结果与讨论

APL被用来检测脂质相变和单层膜是否平衡，也可以判断单层膜上脂质分子排列的疏密程度。在没有纳米粒子的情况下，当单层膜达到平衡后，单层膜通过压缩和膨胀会自发地达到 0和 23 mN/m的表面张力。计算得出表面张力为0的单层膜APL为 0.48 nm2，此时脂质分子处在 LC相，表面张力为23 mN/m的单层膜APL为0.55 nm2，此时脂质分子处在LC+LE相，张力减小时表面积减小了大约13%，由图3可以看出，在张力较小时单层膜上的脂质分子排布比张力较大时更加有序。这些结果表明活性剂单层膜在表面张力为 0时处在 LC相，并且当表面张力升高到23 mN/m时会转化到LC+LE相。

图3 两种不同初始表面张力的活性剂单层膜的快照(俯视图)。在0时为液态收缩相，在23 mN/m时为液态收缩和液态扩张的混合相

表面活性剂单层是由饱和脂质和不饱和脂质共同组成的，脂质的有序参数用来计算和观测单层膜的结构取向，平均脂质有序参数在-0.5～1之间变化(-0.5表示脂质尾部绝对无序，1表示脂质尾部绝对有序)，脂质分子的有序参数

其中，Sz表示有序参数，θ是脂质尾部粒子之间的键与膜法线方向的夹角，角括号表示取一段时间上的平均值。

DPPC和POPG分子的sn1尾链和sn2尾链在膜表面张力为0和23 mN/m时的有序参数如图4所示。从图中可以看出，在相同的表面张力下，DPPC比POPG更加有序，这是因为POPG尾链中碳碳双键的存在。另外，DPPC和POPG分子在APL较小的时候更有序。

此前的研究[14]表明，疏水性纳米粒子可以被压缩状态的脂质单层包裹。图5显示了金纳米粒子与具有不同初始表面张力的脂质单层作用的过程，可以看出在初始表面张力为0时，立方体状和球状AuNP可以穿过脂质单层并附着于单层下方，破坏了单层的结构。AuNP使得单层向下凸起形成了“半囊泡”结构，随着模拟的进行，这个半囊泡并未从脂质单层上脱落，并且脂质与纳米粒子的相互作用使得纳米粒子从单层中吸附脂质分子，进而导致了脂质单层上孔隙的形成，使得磷脂分子的有序参数减小。由于金纳米粒子具有疏水性表面，所以脂质分子的尾部朝向纳米粒子表面。立方体状纳米粒子至少有一个尖角，它与磷脂层的初始接触面积较小，容易穿透磷脂层，这与之前的一项研究结果类似[15]。而盘状和棒状的AuNP均未能穿透单层，而是嵌入了单层中。在初始表面张力为23 mN/m时，四种纳米粒子均嵌入单层中，未能穿透单层。由此可以看出纳米粒子在脂质单层张力较大时不易穿过。

图4 在没有金纳米粒子时DPPC和POPG分子的有序参数

图5 不同形状的金纳米颗粒与脂质单层(初始表面张力分别为0和23 mN/m)相互作用的动力学过程

图6为脂质单层中DPPC分子和POPG分子尾链有序参数，可以看出当 APL较大时，不同形状的纳米粒子对有序参数的影响较小。当 APL为0.48 nm2时，与棒状和盘状AuNP作用的磷脂分子有序参数比与球状和立方体状AuNP作用的有序参数大的多，这是由于立方体状和球状的纳米粒子在单层上凸起形成了半囊泡，大量磷脂分子吸附在粒子表面，从而使得有序参数变小。

图6 四种不同形状的金纳米粒子对DPPC和POPG分子平均有序参数的影响(实线代表APL=0.48 nm2，虚线代表APL=0.55 nm2)

图7显示了平均有序参数随时间的变化，可以看出在APL较小时，与立方体状和球状纳米粒子作用的磷脂分子的有序参数逐渐减小，且与球状纳米粒子作用的磷脂有序参数减小得更快，在100 ns左右便达到稳定，而与立方体状纳米粒子作用的磷脂有序参数在350 ns才达到稳定。与盘状和棒状纳米粒子作用的磷脂有序参数无明显变化。在APL较大时，有序参数均无太大变化，且与立方体状纳米粒子作用的磷脂有序参数最小。

图7 DPPC分子尾链平均有序参数随时间的变化

图8显示了四种纳米粒子与脂质分子间范德华作用的变化，范德华作用都较为稳定。APL较小时的范德华作用略大于在 APL较大时的作用，因为APL较小时脂质分子排布更致密，所以有更多的脂质分子与纳米粒子作用，且立方体状纳米粒子与脂质分子的范德华作用最大，棒状纳米粒子与脂质分子的范德华作用最小。

3 结论

本文通过粗粒化分子动力学模拟的方法，研究了不同形状的金纳米粒子与磷脂单层膜之间的相互作用。结果表明，立方体状和球状的金纳米粒子在较小的初始表面张力下可以穿过磷脂单层并附着于单层下方，盘状和棒状的金粒子在两种表面张力下均嵌入磷脂单层，未能穿过单层。立方体状和球状的金纳米粒子对磷脂分子有序参数的影响更加显著。本文的研究从分子水平上表明了吸入金纳米粒子可能产生的后果，对未来关于金纳米粒子作为污染物及药物载体研究提供了参考。

图8 四种不同形状的金纳米粒子与脂质单层的范德华作用随时间的变化