凤尾草提取物抗腹泻的药理学研究

南苹瑶，王立琦，鲍光明，郭小权，王小莺*

（1.江西农业大学兽药研究所，江西南昌 330045；2.陕西省渭南市动物疫病预防控制中心，陕西渭南 714000）

【研究意义】在畜牧生产中，畜禽腹泻是养殖生产的一类常见疾病，严重阻碍养殖业的发展[1−2]。为防治疾病及促进生产，大量抗菌药物应用于养殖生产从而导致抗菌药物的滥用，引起药物残留，细菌耐药谱不断扩大。因此，寻找一种安全有效的治疗腹泻的高产天然药物至关重要。中药凤尾草历史悠久、资源丰厚，具有广谱抗菌、抗肿瘤及保肝作用[3]。其能治痢疾、肠炎、肝炎等[4]。凤尾草在兽医临床上对猪、禽、牛、兔的痢疾能起治疗作用。研究凤尾草提取物抗腹泻的药理试验，为开发凤尾草资源提供理论依据。【前人研究进展】凤尾草的药用价值高，临床治疗效果优良。陈明仁[5]研究表明，凤尾草合番石榴叶对急性湿热型腹泻具有良好的治疗作用；胡荷斌等[6]以复方凤尾草胶囊治疗小肠湿热和小儿消化不良，发现其对急性肠炎、慢性局限性肠炎及小儿腹泻的显效率分别为94%、97.4%及93.3%；【本研究切入点】凤尾草作为一种历史悠久的中药，国内外对凤尾草提取物抗腹泻的药理研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】本文通过研究凤尾草提取物对小鼠小肠推进运动和胃排空的影响，醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增高的抑制作用、蓖麻油致小鼠腹泻的对抗作用，在抗炎、止泻等方面探究凤尾草提取物抗腹泻的药理学作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 受试药与试剂 凤尾草，全草采摘于江西省南昌市梅岭风景区内。

0.7%醋酸生理盐水溶液的配制：移液枪准确吸取0.35 mL纯冰醋酸，溶于50 mL的生理盐水中。

0.5%伊文思蓝生理盐水溶液的配制：精确称取伊文思蓝0.5 g，充分溶解于100 mL的生理盐水中。

多潘立酮混悬液的制备：多潘立酮片10 mg/片，将多潘立酮片用研钵充分研磨至粉末，多潘立酮以15 mg/kg的剂量，用蒸馏水按5 g/L的浓度加羧甲基纤维素钠配成1.5 mg/mL的混悬液。

阿司匹林混悬液：阿司匹林肠溶片100 mg/片，肠溶片用研钵充分研磨至粉末，将阿司匹林肠溶片以5 g/L的浓度加羧甲基纤维素钠制成20 mg/mL的水悬液，以0.2 g/kg剂量进行灌胃，按0.1 mL/10 g灌胃给药。

LB肉汤培养基、普通营养琼脂培养基按常规方法来配制，121 ℃高压灭菌处理，4 ℃保存备用。

半固体营养糊的制备：分别准确称取8 g奶粉、4 g糖、1 g活性炭末和4 g淀粉溶于125 mL蒸馏水中，加入5 g羧甲基纤维素（CMC），一边以电炉加热一边搅拌，使羧甲基纤维素尽量溶解。配制成100 mL约100 g的黑色半固体糊状物。冰箱4 ℃冷藏备用，用时水浴锅预热至37 ℃。

炭末悬液的制备：准确称取5 g活性炭末、1 g羧甲基纤维素（CMC）溶于100 mL双蒸水中，边加热边搅拌均匀制备成炭末悬液，冰箱4℃冷藏备用，使用时水浴锅预热至37℃。

1.1.2 主要仪器 50 g高速万能粉碎机（DFT−50A，温岭市林大机械有限公司）；循环水式真空泵（SHZ−D（Ⅲ），巩义市予华仪器有限责任公司）；旋转蒸发仪（ValueDightal G3，上海亚荣生化仪器厂）；数显恒温水浴锅（HH−4，国华电器有限公司）；

1.2 试验方法

1.2.1 凤尾草乙醇提取物的制备 将采摘的凤尾草全草洗净、晒干或放置在烘箱内烘干，中药粉碎机粉碎成粉末，密封保存随时干燥。准确称取100 g凤尾草粉末，粉末用滤纸包成长条形，按照料液比为1∶30，用70%乙醇溶液将滤纸浸泡在圆底烧瓶内，提取温度为50 ℃，乙醇回流提取3次，每次30 min，合并3次提取液。所得提取液即为凤尾草的乙醇粗提液，温度控制在60 ℃，提取液用旋转蒸发仪进行浓缩，回收乙醇，将醇提物浓缩至少量液体后，倒入25 mL干燥的小烧杯内，40 ℃干燥至膏状物，至质量不变。膏状物于−20 ℃冷冻保存。临用前用10%的DMSO溶液溶解制成所需药液，4 ℃冷藏保存备用。

1.2.2 凤尾草对正常小鼠小肠推进运动和胃排空的影响 取健康小鼠36只，体质量18～22 g，雌雄各半，随机分为正常对照组、凤尾草乙醇提取物高、低剂量组3组，每组各12只，雌雄各6只，雌雄分笼饲养，做好标记。正常对照组小鼠按0.1 mL/20 g灌胃生理盐水，凤尾草乙醇提取物高剂量组、低剂量组分别以5 g/kg、2.5 g/kg剂量，按0.1 mL/20 g灌胃稀释好的凤尾草提取液，连续给药4 d，末次给药前禁食24 h，禁水2 h，给药后1 h每只小鼠以0.6 mL/只灌胃半固体炭末混悬液，给完20 min后脱颈椎处死所有小鼠，开腹，结扎胃贲门和幽门，小心取下胃，用滤纸拭干后称胃全质量，然后沿胃大弯剪开胃体，洗去胃内容物后滤纸拭干，称胃净质量[7]。胃内残留物质量为胃全质量和胃净质量的差值，胃内残留率为胃内残留物占所灌半固体糊状物质量的百分比。同时迅速取出小肠全肠，轻轻剥离肠系膜后将小肠拉成直线，测量幽门至回盲部的小肠全长[8]，及炭墨推进长度为幽门至黑色半固体糊前沿的距离。以炭墨推进长度占幽门至回盲肠部全长的百分率为小肠推进率。试验中所得数据应用SPSS17.0做数据处理，进行组间独立样本t检验，以表示。

1.2.3 凤尾草对多潘立酮负荷下的小鼠小肠推进作用 取健康小鼠30只，体质量18～22 g，雌雄各半，随机分为正常对照组、单纯多潘立酮组、单药凤尾草乙醇提取物组3组，每组小鼠各10只，雌雄各5只，雌雄分笼饲养，做好标记（以左上/右上/左下/右下/不标记区分）。正常对照组和单纯多潘立酮组组小鼠按0.1 mL/10 g灌胃生理盐水，凤尾草乙醇提取物组以5 g/kg、0.1 mL/10 g剂量灌胃稀释好的中药提取液，连续给药4 d，末次给药前禁食12 h，禁水2 h，除正常对照组外，其他组均以0.1 mL/10 g先灌胃多潘立酮混悬液，灌胃完后30 min，正常对照组和单纯多潘立酮组灌胃等体积生理盐水，凤尾草乙醇提取物组灌胃中药提取液，灌胃给药30 min后，按0.25 mL/10 g给予炭末灌胃，20 min后采用颈椎脱臼法处死所有小鼠，开腹，结扎胃幽门，迅速取出小肠，轻轻剥离肠系膜后将小肠拉成直线，测量幽门至回盲部的长度为小肠全长，幽门至炭墨前沿的距离为炭墨推进长度[9]。以炭墨推进长度占幽门至回盲肠部全长的百分率为小肠推进率。试验中所得数据应用SPSS17.0做数据处理，进行组间独立样本t检验，以表示。

1.2.4 凤尾草对小鼠腹腔通透性试验 取健康小鼠32只，均为雄性，体质量为（25±2.5）g，随机分为模型组、阳性对照组和凤尾草高、低剂量组四组，每组8只小鼠，分两笼饲养，每笼各4只，分别做好标记（分别按左上/右上/尾/不标记进行区分），灌胃前记下每组每只小鼠的体质量。其中凤尾草高、低剂量组分别以5 g/kg、2.5 g/kg剂量，按0.1 mL/10 g灌胃稀释好的药液，阳性对照组以0.2 g/kg剂量灌胃阿司匹林混悬液，模型组小鼠按0.1 mL/10 g灌胃生理盐水。连续给药5 d。每只小鼠给药1 h后按0.2 mL/只尾静脉注射0.5%伊文思蓝生理盐水溶液，尾静脉注射不成功者宜舍弃。尾静脉注射完立即按0.1 mL/10 g腹腔注射0.7%醋酸生理盐水溶液，20 min后脱颈椎处死小鼠，处死小鼠腹腔注射3 mL生理盐水，并轻轻按揉腹部，对腹腔进行充分洗涤，后小心将腹部皮肤肌肉剪开一个小口，用镊子小心夹紧提起腹壁肌肉，以1 mL注射器小心多次吸取洗涤液，合并后3 000 r/min进行离心15 min，取上清液（必要时生理盐水进行稀释后）用双光束紫外可见分光光度计于590 nm处测每只小鼠腹腔洗涤液的OD值。得到各组小鼠腹腔洗涤液的OD值后，SPSS17.0进行分析，组间独立样本t检验分析差异性，以表示。

1.3 凤尾草对蓖麻油所致小鼠腹泻的影响

1.3.1 随机分组与给药 取健康小鼠60只，体质量18～22 g，雌雄各半，随机分为正常对照组、模型组、凤尾草高、低剂量组4组，每组各10只，雌雄各5只，雌雄分笼饲养，试验过程中做好标记（分别以左上/右上/左下/右下/尾/不标记进行区分）。正常对照组和模型组小鼠按0.1 mL/10 g灌胃生理盐水，凤尾草乙醇提取物高剂量组以5 g/kg、低剂量组以2.5 g/kg按0.1 mL/10 g灌胃稀释好的药，连续给药3 d，每次给药前、后均各禁食禁水2 h，末次给药后30 min，除正常对照组给予同体积生理盐水外，各组均以0.2 mL/只灌胃蓖麻油，试验中给予药液与给予蓖麻油的灌胃针完全区分开，给予蓖麻油的灌胃针每次用完用纸拭干，并多次沸水浸泡。而后将小鼠反罩在烧杯下，烧杯下铺滤纸片，观察5 h，每隔30 min更换滤纸一次。观察各组小鼠体态皮毛、精神状态、行为变化、大便等的变化。试验中所得数据应用SPSS17.0做数据处理，进行组间独立样本t检验，以表示。

1.3.2 观察指标 （1）每小时腹泻发生率和总腹泻率。每小时腹泻发生率：每组小鼠每小时内的腹泻只数与该组小鼠总只数之比。总腹泻率：每组小鼠在观察时间内腹泻只数与该组小鼠总只数之比。

（2）稀便次数、干便次数、总便次数[10]：以滤纸上每粒或每堆（指不能分清粒数者）粪便为排便一次；干便不黏连成颗粒状；稀便多不成形，含水量大，内有黏性液体；总便次数为干便次与稀便次数之和数。

（3）稀便率与稀便级、平均稀便级与腹泻指数。平均稀便率：每只小鼠在观察时间内排总稀便次数与总排便次数之比，并求出该组小鼠的平均稀便率。稀便级：表示每只小鼠排稀便的程度，以稀便污染滤纸形成的污迹的直径（cm）大小定级，分为四级，分级标准见表1。污迹为圆形较规则的测其直径；不规则形状则测量其最长和近似圆的直径，两数相加除以2[11]。

表1 稀便级数与污迹直径对照表Tab.1 Comparison table of loose stool grade and diameter of stain

平均稀便级：统计时先逐个测量每只小鼠每一堆稀便的级数，然后将该只小鼠在观察时间内所有的稀便级数相加，除以排稀便次数得每只小鼠稀便的平均级数，最后求出该组小鼠的平均稀便级。

腹泻指数：为稀便级与稀便率的乘积。

（4）稀便抑制率：（模型组每小时的平均稀便数－其余组每小时的平均稀便数）/模型组每小时的平均稀便数×100%

2 结果与分析

2.1 凤尾草对正常小鼠小肠推进和胃排空的影响

正常小鼠的小肠推进作用试验是研究中药抗腹泻机理常用的方法之一。表2的数据显示，凤尾草提取物对正常小鼠胃排空和小肠推进的影响，雌雄小鼠之间有一定的差异。对于雌性小鼠，与正常小鼠相比，凤尾草提取物高、低剂量组均能提高半固体糊胃内残留率及抑制小肠蠕动，5 g/kg的凤尾草乙醇提取物连续给药3 d能显著（P<0.05）提高胃内残留率，表明其有抑制正常雌性小鼠胃排空的作用，并且能极显著（P<0.01）抑制小肠蠕动；对于雄性小鼠，与正常小鼠相比，凤尾草提取物高、低剂量组均能降低半固体糊胃内残留率及促进小肠蠕动，5 g/kg的凤尾草提取物连续给药3 d能显著（P<0.05）降低胃内残留率，表明其有促进正常雄性小鼠胃排空作用，并且能显著（P<0.05）抑制小肠推进。

表2 凤尾草对正常小鼠小肠推进运动及胃排空的影响（n=12，）Tab.2 Effect of Pteris multifda Poir.on small intestine propulsion and gastric emptying in normal mice

表2 凤尾草对正常小鼠小肠推进运动及胃排空的影响（n=12，）Tab.2 Effect of Pteris multifda Poir.on small intestine propulsion and gastric emptying in normal mice

“a”表示与模型组相比差异显著（P<0.05），“A”表示差异极显著（P<0.01）Compared with the model group，“a”means significant difference（P<0.05），“A”means extremely significant difference（P<0.01）

2.2 凤尾草对多潘立酮负荷下的小鼠小肠推进作用

与正常对照组相比，雄性单纯多潘立酮组小肠推进率显著（P<0.05）升高，雌性小肠推进率有所增加，说明雄性胃肠亢进模型建立成功。对于雌性小鼠而言，与正常对照组、单纯多潘立酮组相比，凤尾草乙醇提取物小肠推进率均有所降低，但差异无统计学意义（P>0.05）；对于雄性小鼠而言，与单纯多潘立酮组相比，凤尾草乙醇提取物小肠推进率均减小，凤尾草能显著（P<0.05）减缓小肠蠕动，表明凤尾草乙醇提取物有拮抗多潘立酮，抑制雄性小鼠小肠蠕动的作用。结果见表3。

表3 凤尾草对多潘立酮负荷下的小鼠肠推进的影响（n=10，）Tab.3 Effect of ethanol extract of Pteris multifda Poir.on intestinal propulsion of mice under the loading of domperidone

表3 凤尾草对多潘立酮负荷下的小鼠肠推进的影响（n=10，）Tab.3 Effect of ethanol extract of Pteris multifda Poir.on intestinal propulsion of mice under the loading of domperidone

与正常对照组相比，“a”表示差异显著（P<0.05）；与单纯多潘立酮组相比，“b”表示差异显著Compared with the normal control group，“a”means significant difference（P<0.05）；Compared with the simple domperidone group，“b”means significant difference

多潘立酮是目前临床上应用较广泛的促进胃肠动力药，该药进入动物体内，不通过血脑屏障，直接作用于消化系统，促使胃肠道的平滑肌出现紧张性收缩，从而促进胃排空和小肠的蠕动。本试验通过给予小鼠多潘立酮的前提下研究凤尾草对小肠推进作用的影响，5 g/kg凤尾草乙醇提取物能明显降低雄性小鼠小肠推进率，雌性小鼠作用不显著，表明凤尾草具有拮抗胃肠平滑肌紧张性收缩的兴奋功能，具有调节胃肠运动的作用，使得肠道恢复节律性的运动，为探究凤尾草的抗腹泻机理研究奠定了基础。

2.3 凤尾草对小鼠腹腔通透性的影响

与模型组相比，凤尾草高、低剂量组与阿司匹林组均能降低小鼠腹腔毛细血管通透性，凤尾草提取物高剂量组作用更强。5 g/kg凤尾草乙醇提取物与模型组差异极显著（P<0.01），抑制率达37.327%。由此可见，5 g/kg的凤尾草乙醇提取物的抗炎活性较好。结果见表4。

表4 凤尾草对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响（n=8，）Tab.4 The effect of Pteris multifda Poir.on the permeability of capillaries in the abdominal cavity of mice

表4 凤尾草对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响（n=8，）Tab.4 The effect of Pteris multifda Poir.on the permeability of capillaries in the abdominal cavity of mice

与正常对照组相比，“A”表示差异极显著（P<0.01）Compared with the normal control group，“A”means extremely significant difference（P<0.01）

醋酸致小鼠腹腔毛细血管的增高试验是常用的抗炎性渗出典型的模型之一。本研究显示，5 g/kg、2.5 g/kg凤尾草乙醇提取物均能抑制冰醋酸所致小鼠腹腔毛细血管的增高，5 g/kg作用极显著，说明凤尾草乙醇提取物在一定浓度下极显著抑制小鼠腹腔的急性炎性渗出。而选用的阿司匹林肠溶片作为阳性对照药，抑制率为30.415%。近年来，黄酮类化合物作为多数中药的主要成分，其体内抗炎作用已有研究。崔伟等[12]发现甘青虎耳草总黄酮能明显抑制冰醋酸引起的小鼠腹腔毛细血管通透性增强，并且能有效抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀；天山堇菜总黄酮在0.08 g/kg、0.16 g/kg、0.32 g/kg可显著抑制冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管炎性渗出，在0.16 g/kg、0.32 g/kg可显著抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀[13]；说明可能是凤尾草中的黄酮类化合物发挥了抗炎作用。另外，吴立夫等[14]研究了苦参和风轮莱对醋酸所致的兔肠黏膜毛细血管通透性增加的影响极显著，来推测其对急性肠炎的作用。

2.4 凤尾草对蓖麻油所致小鼠腹泻的影响

除正常对照组外，各组灌胃蓖麻油一段时间后，均表现出一定程度的腹泻状况，腹泻小鼠表现为精神沉郁，倦怠乏力，毛发粗糙，眼周围有分泌物，不易睁开，排稀便次数有所增加，粪便较正常小鼠粪便偏黄褐色，无固定形状，粪便含水量增加，内有粘稠性液体，固体内容物较少，表明模型建立成功。

对于0～5 h内每小时的稀便数，除正常对照组外，各组灌胃蓖麻油均出现拉稀便，模型组在0～3 h内拉稀程度随着时间而加重，凤尾草高、低剂量组在0～1 h稀便数量与模型组相当，在1～2 h比模型组严重，但在2～5 h稀便数远低于模型组，说明凤尾草的止泻起效时间在2 h。对于每小时的腹泻发生率，与模型组相比，凤尾草高、低剂量组0～5 h内的腹泻发生率均降低，高剂量组差异显著（P<0.05），说明凤尾草发挥止泻疗效的时间主要在2～5 h。对于稀便抑制率，凤尾草高剂量组在0～4 h达到最大值26.415%，说明5 g/kg凤尾草在4 h时抑制小鼠腹泻作用最强。对于0～5 h的总腹泻率，除正常组外，凤尾草高剂量组在0～1 h、0～2 h、0～3 h、0～4 h的总腹泻率远低于模型组，说明5 g/kg凤尾草发挥止泻疗效有较好的效果且持续时间久。与模型组相比，凤尾草高剂量组在0～2 h的平均稀便级显著降低（P<0.05），0～3 h、0～4 h极显著降低（P<0.01），平均稀便率和平均腹泻指数相对降低，说明5 g/kg凤尾草在2～4 h的止泻疗效最显著。表明对于蓖麻油致小鼠腹泻模型试验中，凤尾草乙醇提取物有较好的止泻作用，凤尾草提取物高剂量组疗效比低剂量组好。结果见表5。

表5 凤尾草乙醇提取物对蓖麻油所致小鼠腹泻的影响（n=10，）Tab.5 Effect of ethanol extract of Pteris multifda Poir. on diarrhea induced by castor oil in mice

表5 凤尾草乙醇提取物对蓖麻油所致小鼠腹泻的影响（n=10，）Tab.5 Effect of ethanol extract of Pteris multifda Poir. on diarrhea induced by castor oil in mice

“a”表示差异显著（P<0.05），“A”表示差异极显著（P<0.01）Compared with the model group，“a”means significant difference（P<0.05），“a”means extremely significant difference（P<0.01）

蓖麻油与番泻叶、硫酸镁、大黄等是致小鼠腹泻模型的常用药物，是研究中药抗腹泻机理常见的方法。蓖麻油属于刺激性泻药，是能够刺激小肠黏膜的致泻剂。蓖麻油于小肠上部被脂肪水解酶水解成蓖麻醇酸，肠道平滑肌被水解产生的蓖麻醇酸刺激，而损害肠粘膜细胞并引起炎症，使得肠蠕动加快，抑制了水和电解质的吸收，进而出现渗出性的腹泻[15]。选用蓖麻油做诱导小鼠小肠腹泻，是通过促进炎性因子的合成和释放，刺激膜整合蛋白，引起细胞进行信号应答，增大肠液的分泌量以至于超过肠道的重吸收能力来造成的。

凤尾草具有抗渗出性腹泻的作用，其主要成分黄酮类化合物具有抗炎、抗菌、抗氧化作用，作为凤尾草的物质基础，可能是通过抗炎作用对抗炎症介质的致泻作用而发挥着抗腹泻效果。

3 讨论

随着全球新冠肺炎的爆发，中药在全世界范围内受到广泛认可。中药发挥作用的整体性、成分的可变性及之间相互作用的难以预测性、作用靶点的复杂性等，已成为研究中药抗腹泻机制的难点。目前许多研究者对中药抗腹泻作用机制进行研究，发现中药的抗菌、抗腹泻密切相关，多方位发挥作用。

采用醋酸致小鼠腹腔膜毛细血管通透性增大的模型考察中药抗炎作用，由腹腔渗透液中生物染料伊文思蓝的含量差异反应中药作用后毛细血管通透性的不同。炎症介质是一类致泻性自体活性物质，临床所见的大多数泻药和腹泻性疾病均是致病因子使肠道发生炎症，从而释放各种炎性介质如花生四烯酸、前列腺素和组胺等，导致动、静脉扩张，增加血管渗透压，引起体液和血浆蛋白的渗出。因此，药物可以通过抗炎过程来达到止泻效果。本文中凤尾草提取物能抑制急性炎性渗出作用，可能是抑制液体从肠壁向肠腔的渗出而抑制急性肠炎的渗出。

蓖麻油致小鼠腹泻模型及小鼠小肠推进试验是探究中药抗腹泻机理常用的方法。寄生于肠道内的致病性大肠杆菌是引起畜禽腹泻的一大原因。大肠杆菌在小肠内定殖，其黏附作用借助于菌毛黏附素和靶细胞表面相应的受体，产生肠毒素，破坏小肠内水和电解质的正常吸收和排泄的动态平衡，而引起剧烈腹泻。患大肠杆菌病的畜禽常伴发急性肠炎，主要病变在小肠，与蓖麻油作用部位一致，蓖麻油通过促进炎性介质的释放致炎、致腹泻。凤尾草抗蓖麻油引起的腹泻有很好的止泻效果，为研究其对实验性大肠杆菌腹泻的药效试验提供了理论基础。