多重实时荧光定量聚合酶链反应在急性视网膜坏死诊疗中的应用

马清悦 孟 超 胡 磊

山东第一医科大学(山东省医学科学院)1.研究生部，2.生命科学学院，山东 泰安 271016；3.山东第一医科大学第二附属医院眼科，山东 泰安 271000

急性视网膜坏死(acute retinal necrosis，ARN)是一种罕见的病毒性葡萄膜炎综合征，其特征是重度全葡萄膜炎伴视网膜动脉炎、周边大量渗出、视网膜坏死、玻璃体高度混浊以及后期出现视网膜裂孔及视网膜脱离。本病起病急，进展十分迅速，及时精准的治疗对其预后意义重大。眼内疾病中疱疹病毒感染的诊断之前常依赖于传统方法，例如病毒分离方法，但类似于这种检测方法，通常由于样本量小和病毒浓度低而导致得到如假阴性等失败的实验结果，因此延误了诊断，错过治疗的最佳时机。日本ARN研究组在2015年将病因学诊断依据纳入ARN诊断标准中。多重实时荧光定量PCR技术是一种建立在传统PCR技术基础上，针对病因学的更为敏感和特异的实验室检测方法，也有利于协助开展迅速有效的治疗，防止长期眼部损伤和视力丧失。为此，本文针对PCR技术对急性视网膜坏死快速诊疗过程中的重要作用进行综述。

1 PCR技术概述

自20世纪80年代首次被描述以来，PCR已被用于快速准确地扩增样品中的靶DNA片段[1]。PCR是体外酶促合成DNA或RNA片段的方法。它包括一个反应，该反应主要包括在高温变性、低温退火及适温延伸等三步，并且其循环非常短，从而可以迅速扩增DNA或RNA片段，达到数小时内扩增百万倍的速度。PCR的问世提供了快速、灵敏、样品需求少的技术诊断，彻底变革了病原体的检测方法[2]，已被多个领域重视并应用，如其可以用于遗传病的检测、在基因层面上对病毒细菌等感染进行病原体诊断、对临床无症状的艾滋病病人进行体内免疫缺陷病毒感染的监测、对白血病细胞的监测来判断白血病复发概率及预后等。诸如此类，PCR技术的发现对临床诊断带来革命性的意义。有研究表明，PCR技术比以前常用的Goldmann-Witmer系数标准病原体方法更为敏感[3]。

2 ARN主要检测及诊断方法的变革

ARN是一种严重危及视力的病毒性葡萄膜炎，属于眼科急症[4]。病因学研究发现ARN主要由疱疹病毒引起，最常见的病原体是水痘带状疱疹病毒(VZV)，其次是单纯疱疹病毒1和2(HSV1和HSV2)[2]。本病起病急骤，病程进展早期也易与其他疾病相混淆，并且病程进展十分迅速。鉴于病原体复制的快速性会对诊断和治疗方向造成干扰，故及时准确的对ARN作出诊断对治疗及预后意义重大[5]。最早对于病原体的判断方法，主要依赖于一些传统的实验室检查技术包括血清抗原抗体检测、病毒培养检查等，但由于血眼屏障(包括房水屏障和视网膜血屏障)的存在，血液中病原微生物和免疫指标的检测难以准确反映出眼局部感染情况，故在临床应用中存在局限性，后来对于眼内疾病中疱疹病毒感染的诊断，常依赖于传统的例如检眼镜观察、病毒分离方法等，但根据眼部体征及常规实验室检查的方法诊断准确率不高，并且也会由于样本量小和病毒浓度低而导致得到诸如假阴性等失败的实验结果，因此延误了诊断，进而耽误治疗的最佳时机[6]。相比1994年美国葡萄膜炎协会对ARN的诊断主要是根据眼部表现及病程演变方面，日本ARN研究小组在2015年诊断标准中将眼局部眼内液病因学检测结果补充为ARN诊断标准之一[7]。Takase等[1]提出制定该标准的两点原因，首先，ARN的诊断应与眼内液的病毒学检测结果相结合，其次，新的诊断标准可以帮助疾病进行早期诊断对应的病原体从而获得更好的视觉预后。病毒性眼部感染的早期诊断和及时治疗可能有助于预防严重的眼部结构损害，并有助于维持良好的视觉功能[8]。

在眼部结构上分析，进行眼内液检测也是很有必要的。眼内液是眼球液的总称，包括房水、玻璃体液、视网膜下液和脉络膜上积液。由于眼球是一个封闭的球体，并且有血眼屏障(包括房水屏障和视网膜血屏障)的存在，房水的成分与血浆有很大不同，因此血液中病原微生物和免疫指标的检测很难准确反映出眼睛的局部状况。国外已有研究证实，眼内液样品(房水或玻璃体)的PCR分析已被用作诊断感染性葡萄膜炎疾病并被确认是临床怀疑的有效、高度灵敏和特异的检测方法[9]。

3 多重实时荧光定量PCR技术进展与ARN快速诊治

传统的PCR技术是一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度，如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行，并且需要相对大量的样本才能对多种传染源进行分析。实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction)技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，它的技术原理是在扩增时加入了用同位素及荧光素等标记的引物，使引物和荧光探针同时与模板特异性结合并扩增，实现了在加热冷却循环中监测荧光强度，此荧光强度与靶DNA的初始浓度成正比，这样就可在计算机上观察到量化的实时结果的输出。它的出现使分子诊断领域发生了重大变革，使得普通PCR技术实现了从定性到定量的飞跃，在接下来的几年间，在此基础上又增添了多重性的功能。这种精确、敏感、污染少的核酸定量技术，对传染病的快速诊断、病毒分型、耐药突变体监测以及新发传染病病原体快速监测等方面发挥重要作用，并已在临床医学及生物医学基础科研中得到广泛应用[10]。

得益于以上技术路线的进展，与以往应用普通PCR技术相比，多重实时荧光定量PCR技术在急性视网膜坏死快速诊断应用中主要有以下重要意义：

第一，通过一次可靠、灵敏且特异性强的实验室检查来明确感染的病因，可将正确的诊断时间和治疗开始时间尽量提前，从而尽可能保留视力并预防后期并发症，例如视网膜脱离、眼内瘢痕形成和永久性视力丧失[11]。其灵敏性表现在可以在不到0.1 mL眼内液的情况下一次准确检测出最常见的病原体[12]。即使对于很小的眼内液样本，PCR检测的阴性预测值的价值也很高[1]。Wendy等人[13]通过对所收集的15年来的数据的分析表明，有大约18%的ARN患者也同时伴有疱疹病毒性角膜炎，疱疹病毒性角膜炎可发生在ARN诊断之前、同时或之后。故当患者患有疱疹病毒性角膜炎等诸如此类的疾病时，对患者进行仔细的眼前段检查及眼内液PCR检测都是十分有必要的，以查明是否并发疾病。尽管眼内液的PCR检测是一种侵入性的检测方法，但它在识别葡萄膜炎疾病的感染病学病因方面起着举足轻重的作用，因此应被视为是任何可疑的感染性葡萄膜炎的辅助检查[15]。

该技术对于排除一些鉴别诊断也发挥重要的作用[15]。例如，最近的一项研究报道了1例根据临床表现该患者被认为是由于免疫抑制而继发于疱疹感染的进行性外层视网膜坏死，然而，通过进一步对该患者的多重实时定量PCR技术分析，却发现有弓形虫的存在，这样在治疗上转变针对弓形虫感染的抗微生物治疗会带来更大的预后收益[16]。并且，多重实时定量PCR技术甚至能够可靠地检测出样本存在着的少量的病毒或寄生虫DNA，从而确定或排除对感染的怀疑，使皮质类固醇或其他免疫抑制的疗法及时放心的应用[17]。通过以上这些例子，也证实了在某些情况下，由于临床体征可能重叠，多重实时荧光定量PCR技术是确保准确诊断和随后有效治疗的宝贵工具。文献报道，很多实验室都开始使用多重实时荧光定量PCR技术来准确识别感染性病因，这可能会成为标准的实验室诊断方法[19]。

多重实时荧光定量PCR技术使鉴定和定量病毒基因组成为可能，它可以提供每毫升病毒拷贝数的信息，还可用于监测随着时间的推移病原体对治疗的反应[16]。其可以定量测定病毒的优势有利于对疾病进展及预后及时判断[19]。并且由于该技术的实时性，检测人员可以在加热/冷却循环中监测荧光强度，该强度是与靶DNA的初始浓度成正比的，因此，可以确定在这些循环中什么时候可以最早检测到目标DNA，同时也可以确定样品中检测到的靶序列的浓度[20]。检测过程中可将引起急性视网膜坏死等感染性葡萄膜炎的多种常见病原体组合到一个多重检测法中，而且所有靶目标的检测均可在2 h左右完成，由此也具有缩短实验室报告时间的额外优势[21]。

此外，与玻璃体液相比，抽取前房水是一种更安全、侵入性更小的技术[22]。但需要注意到的一点是，相同情况下，玻璃体液的病毒检出阳性率可能高于前房水，并且在未用药或用药1周内检测的阳性率较高。在临床实践中我们也要考虑到不同样本的特性。

4 总结和展望

综上所述，基于精准医学原则的多重实时荧光定量PCR技术是快速确诊或排除如急性视网膜坏死等感染性葡萄膜炎为病因的疾病的重要诊断工具，可以节省检测时间，提高检测的准确率，为病原体的早期检出提供准确信息。但仍有一些亟待解决的问题，如部分样本如玻璃体液获得方式相对不易，并且目前检验成本较高，因此作为一种临床常规检查受到一定限制。但不可否认的是，在更多具有挑战性的感染性葡萄膜炎病例中，该技术会成为眼科诊断标准的重要组成部分。