Mago nashi、Y14 蛋白复合物参与生殖和细胞调控的研究进展

王晓楠

（安徽医科大学，安徽 合肥 230000）

0 引言

Mago nashi ( 日语，意思是没有子孙，简称mago) 基因最早是Boswell[1]等在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster, D.melanogaster) 中发现的一种母体效应基因(Maternal genes)，即在母体卵发生过程表达，在成熟的卵母细胞作用或者是对成熟的卵母细胞作用。该类基因不影响母体本身，但是产生后代所必需的。之后，人们从诸如模式生物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans, C.elegans)[2]、低等真核生物斑马鱼[3]、以及高等哺乳动物人[4]和血吸虫[5]等多细胞生物中也发现了mago 基因。

Y14 基因在2000 年间由多家实验室几乎同时报道，由于他们使用的实验材料和命名原则不同，在名称上存在一定的差异。Zhao[4,6]等利用酵母双杂交从人脑胚胎cDNA 文库中分离出一个655bp 的cDNA 片段，是编码黑腹果蝇mago基因的人类同源物，即 MAGOH。利用人MAGOH 作为诱饵蛋白，获得了4 个独立的cDNA 克隆，它们编码了一个含有保守RNA 结合区不同长度的新蛋白，因蛋白结构中含有一个RNA 识别模序8，所以命名为RBM8 (RNA binding motif protein 8)。Kataoka[7]等以Hela 细胞为材料，用缺少氨基末端的RanBP5 蛋白筛选到17 个阳性克隆，其中14 个克隆与一个假想的RNA 结合蛋白相似，因此命名为Y14。Mohr[8]等以果蝇的mago 融合蛋白为诱饵，用酵母双杂交方法获取了一个与mago 相互作用的未知基因，因此根据性质将其命名为Tsunagi(tsu，日语，意思是连接或结合)。命名上的多样性说明大家对这个蛋白的认识还未统一，但这几家实验室所得到的结果具有很大的相似性，即蛋白序列中含有一个进化中高度保守的RNA 结合域(RNA binding domain, RBD)，与核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP) 家族的RNA 结合蛋白相似。在体内和体外实验中，它们形成复合物共同发挥生物学作用，参与多种细胞活动过程。

1 Mago nashi 和Y14 蛋白的结构特点

Mago 和Y14 蛋白在进化中高度保守，其同系物从高等哺乳动物人到低等的真核生物中都保守表达。果蝇特异性表达的mago 蛋白与线虫的同系物有80%的同源性[2]，与人的mago 蛋白有88%的同源性[3]。果蝇的Tsunagi 蛋白与人的RBM8 具有63%的同源性和72%的相似性[6]。Kataoka[7]等利用RBM8 筛选爪蟾卵母细胞cDNA 文库，发现RBM8 的爪蟾同源蛋白Xe-Y14，并在线虫、鼠、酵母细胞中找到同源蛋白。序列分析表明mago 蛋白中缺乏已知的结构模序，但氨基酸测序发现，Y14 的N 端富含Arg 和Lys，C 端同样富含碱性氨基酸残基，2 个Arg-Ser 二肽重复序列显示Y14 属于SR 蛋白家族。

Y14 蛋白中还包含一个保守的RBD，又称为RNA 识别模序 (RNA recognition motif, RRM)，RRM 模序中有两个高度保守的核糖核蛋白结合模序，分别为RNP1 和RNP2，两个模序间隔25～35 个氨基酸残基。RRM 中有两个蛋白相互作用的平面已经证实，一个是位于两个α-茎环之间的口袋，这个结构在很多蛋白中广泛存在，与pre-RNA 剪接，DNA 互补配对，信号传导等细胞过程有关。另一个是β-片层平面，用来介导Y14 与mago 蛋白相结合[9-11]。采用酵母双杂交、pull-down和免疫共沉淀等方法，已证明在体内与体外，mago 和Y14 之间存在相互作用，形成异二聚体复合物[12]。有研究者分别转染Y14 dsRNA 和mago dsRNA 后，用Western Blotting 分 析SL2 细胞内蛋白表达水平。发现转染mago dsRNA 后的4-6 天，mago 蛋白表达水平下降了5-10%，Y14 蛋白表达也稍有下降。相反，当转染Y14 dsRNA 时，mago 蛋白表达也会下降。这也支持了mago/Y14 是聚合物的观点，还提示聚合物中的一种亚单位的表达水平受抑制时，会影响另一个成分的表达[13]。

2 Mago nashi 和Y14 蛋白的功能研究

随着mago 和Y14 蛋白的研究不断深入，它们的功能也越来越清楚，包括参与生殖和发育的调节，mRNA 剪接和定位，以及NMD 等细胞活动过程。

2.1 Mago nashi 和Y14 参与生殖和发育的调节

Mago nashi 基因在果蝇生殖系细胞发育过程中，起到两方面的作用，一是滤泡细胞后极的信号转导需要mago 基因编码蛋白的参与，其次在该基因功能受损时，生物体表现为泛雄性化[14]。Boswell[1]等取自野生型果蝇胚胎的mago 物质注射到在早期发育中存在缺陷的突变型胚胎中，结果发现胚胎腹部角质层的缺陷可以缓解，由于突变导致了存在于野生型胚胎中的mago 物质不足，可见mago 是胚胎形成正常的腹部所必需的。他们还发现突变体中少数可以存活的子代体内异染颗粒减少甚至消失，生殖细胞不能生成。Newmark 等[14]分析mago 突变体的表型变化，发现果蝇卵子发生时mago 功能缺失将导致后卵泡细胞至卵母细胞的信号传导受抑制，卵母细胞的前后和背腹轴无法建立，最终导致生殖细胞无法形成。

Lewandowski[15]等解剖0-1 天雌性果蝇卵巢，利用Ranshi蛋白抗体进行免疫共沉淀实验，发现在含有GFP-Mago 的免疫沉淀中检测到Ranshi 和Tsu/Y14，但在缺乏GFP-Mago 或表达nlsGFP 的卵巢提取物中未检测到相关蛋白，这表明含有Mago、Tsu/Y14 和Ranshi 形成的复合物是果蝇胚胎正常发育所必需的蛋白质。

Hir[13]用 双 链RNAi(double-stranded RNAi，dsRNAi) 敲除SL2 细胞内源性的mago 和Y14 蛋白，发现在转染dsRNA后的第四天细胞生长受到抑制，提示mago 和Y14 蛋白缺失可以抑制细胞生长。Kawano[16]等将在C.elegans 中表达的Y14 基因的双链RNA 转入带有质粒L4440 的大肠埃希氏菌HT115 中，以饲喂法导入L4 期幼虫体内产生RNAi，发现Y14基因表达被干扰后，90%虫体后代发育受到抑制：胚胎伸长受限制，部分虫体虽能够孵化但发育至幼虫的L1 期就停止发育。这表明被抑制的Y14 基因在虫体繁殖中发挥了作用。并且，用浸泡法进一步将Y14 RNA 导入野生型胚胎中，结果发现胚胎发育至晚期幼虫时生殖腺内无卵母细胞，而是充满大量精子，为异常的泛雄性化的表现，使得正常的精子-卵母细胞之间的转换发生障碍。Y14 基因RNAi 后子代和胚胎的表型变化提示Y14 基因的表达与后期胚胎发生和成虫性别转换密切相关。干扰线虫mago 基因表达，同样可抑制胚胎后期的性别转换调节[17]，暗示 mago 和Y14 在线虫胚胎发育中有同等重要的作用，表明它们的功能在真核细胞中具有高度保守性。

在秀丽隐杆线虫胚胎中，生殖细胞系是通过连续的不对称细胞分裂而建立的，每个细胞分裂产生一个体细胞和一个生殖细胞系子细胞。PIE-1 是一种必需的母体因子，在胚胎生殖细胞中富集，是生殖细胞正常发育所必需的。Gauvin[18]等 通 过RNAi 筛 选，确 定Y14 和mag1 ( 即 果 蝇 tsunagi 和mago nashi) 是胚胎PIE-1::GFP 水平的调节因子，并且发现Y14 和mag1 在早期胚胎中不调控 PIE-1 的降解、分离或合成，但调控母体中 PIE-1::GFP 的浓度。可见，该复合物在调节母体生殖细胞发育中起着重要作用。Park[19]等使用RNA干扰(RNAi) 方法研究了AtMago 基因在拟南芥中表达下调后，植物的总体发育被推迟，表现在尺寸上变小、茎和根分生组织、花粉和胚胎发育方面都存在缺陷，还出现了无法存活的种子。在RNAi-AtMago 植物中，这种明显呈现出的广泛细胞空泡化、细胞壁异常定位和细胞死亡等缺陷提示Mago蛋白缺失是导致胚胎发育迟缓和胚胎活力降低的原因。用RNAi 方法抑制日本血吸虫Mgao nashi 基因表达，血吸虫表现出泛雄性化[20,21]。

虽然Mago 和Y14 在发育过程中具有相似的特征和功能，但它们的表型并不完全相同。在果蝇卵发生的S9-S10 过程中，纯合的Y14 突变卵母细胞中转化生长因子-促细胞瘤样蛋白(TGF inhibitor /Gurken)和TGF 促细胞瘤(TGF inhibitor) mRNA 经常减少或检测不到[8]。提示这两种蛋白可能在某些发育过程中独立发挥作用。Parma[22]等使用mago 和tsu 的空等位基因生成生殖细胞系克隆,经研究发现，mago 功能缺失时，种系干细胞可以分裂但不能分化。mago 缺失的种系干细胞在至少11 天的时间内产生克隆，这表明mago 对干细胞自我更新来说不是必需的。然而，缺乏tsu/Y14 功能的种系干细胞与野生型无法区分。此外，tsu/Y14 缺失的早期胚胎中，卵母细胞无法集中于单个细胞。可见，不仅mago 是种系干细胞分化所必需的，mago 在这个过程中独立于tsu/Y14 发挥作用。另一方面，tsu/Y14 可能与mago 共同发挥作用，将卵母细胞的发育控制在单个细胞中。

不同于果蝇和线虫的是，人类的MAGOH 和RBM8 基因不仅仅局限于胚胎组织，而是在人体组织中广泛表达，其蛋白表达水平与细胞增殖有关：当细胞增殖时，表达量增高；细胞处于静止状态时，表达量降低[4,6]。免疫染色实验显示MAGOH 和RBM8 蛋白除了在细胞核外还在中心体中共定位[23]。Rosenfeld[24]等发现MAGOH 调节神经发生过程中相关蛋白Lis1 的水平，突变可导致小头症和脑体积减小。MAGOH 的异二聚体复合物Y14 染色体区域的畸变也常与智力残疾和大脑畸形有关。因此推断，MAGOH 和Y14 的生理表达水平可能是正常大脑发育所必需的。通过环己酰亚胺追踪实验发现外源性的Magoh 和Y14 的蛋白降解速度比野生型快，野生型Y14 在细胞中非常稳定，这表明Magoh 和Y14 蛋白复合物的异二聚体结构对维持蛋白的稳定性至关重要[25]。

2.2 Mago nashi 和Y14 参与mRNA 剪接和定位

真核生物基因表达的mRNA 出核转运、mRNA 前体剪接和mRNA 降解等步骤是相偶联的。在研究介导mRNA 出核转运相关蛋白时发现，一些蛋白复合物同时在基因转录、mRNA 前体剪接、出核转运及其下游步骤中出现，Mago nashi和Y14 蛋白就是如此。

Kataoka 等[7]利用荧光标记的抗Y14 抗体4C4，显示Y14 主要存在于细胞核内的核小点(nuclear speckle domain)处，提示Y14 可能和剪接有关。用4C4 在体外有效地与腺病毒晚期启动子Ad2 mRNA 剪接后复合物、鸡d- 晶体蛋白(crystalline)mRNA 剪接后复合物免疫沉淀，但不能与二氢叶酸还原酶(DHFR) mRNA(不含内含子的DHFR mRNA)免疫沉淀，证实Y14 参与mRNA 剪接过程，而且与mRNA 剪接后产物有效地结合。将RNA 微注射入爪蟾卵母细胞的实验结果提示，体内情况亦然。可见Y14 在 mRNA 剪接过程发挥重要作用。

Hir[13]等 将 高 铁 红 蛋 白（β-globin）pre-mRNA 与 重 组GST-MGN/Y14 或GST 以及上述对照RNA 的混合物一起注入果蝇卵母细胞核。孵育2 小时后，解剖卵母细胞，检测抗GST 抗体对胞核内和胞质内β-globin mRNAs 免疫共沉淀的效果。结果显示，注射入MGN/Y14 复合物后，抗体与剪切的RNA 特异性共沉淀，对照组则没有与RNA 结合。此外，抗体与MGN/Y14 复合物在胞核内和胞质内的结合能力没有变化，卵母细胞中也没有检测到大量游离的内源性Y14。由此可见，MGN 与Y14 以复合物的形式参与mRNA 剪接，并伴随mRNA 共同输出至细胞质。

Hachet 等[26]将oskar 基因组中的i1，i2 和i3 三个内含子删除，构建无内含子的转基因oskΔi(1,2,3) 并观察其定位。结果发现在卵子发生早期，oskΔi(1,2,3) mRNA 可以无误地从滋养细胞运输至卵母细胞；当发育至卵子发生中期时，oskΔi(1,2,3) mRNA 即发生错误定位，表现为oskΔi(1,2,3) mRNA 变得弥散开来，分布遍及整个卵母细胞胞质，而对照组的osk mRNA 则集中在卵母细胞后极。如果oskar 被过量表达或被错误定位,它将引发生殖细胞在异位形成。提示oskar mRNA 剪接和其胞质定位紧密联系，oskar mRNA 剪接可以调节mRNA 核蛋白复合物的装配和组成，以利于oskar RNA 在胞质正确定位。

Tsunagi 基因突变的果蝇中，oskar mRNA 可以正确定位在卵母细胞前极，但卵室内的oskar mRNA 则不能在后极定位，相反，野生型果蝇的oskar mRNA 则可以集中并正确定位在卵室后极，可见Tsunagi 蛋白是oskar mRNA 集中并在卵母细胞后极定位必需的。Mago 基因突变的果蝇中，oskar mRNA蓄积在卵母细胞，也不能在卵室后极定位[8]。由此可见，Mago和Y14 与mRNA 的剪接和胞质定位紧密联系，一旦其功能缺失，mRNA 就不能正常剪接和定位。

2.3 Mago nashi 和Y14 参与无意义介导的mRNA 降解

无意义介导的mRNA 降解(NMD)是真核生物mRNA 监测途径，降解含有过早终止密码子(PTCs)的缺陷mRNA。该现象最早是Peltz[27]提出的一种细胞内重要的mRNA 监视机制，被认为在几乎所有的真核细胞中都发挥功能，广泛存在于人体、哺乳动物及真核生物如果蝇、线虫等等，并被认为是进化中高度保守的[28-32]。

NMD 途径通过监视转录过程，将异常mRNA 与正常mRNA 区分开来，并将异常mRNA 迅速降解，及时阻止了对细胞具有潜在危害的截短蛋白的产生，它不仅能够发现和摧毁异常mRNA，而且在调节mRNA 寿命和控制基因活性的过程中起到十分重要的作用。这种mRNA 质量控制机制，可降解含有过早终止密码子(PTCs)的转录本，以保护细胞免受截短蛋白的有害影响[33]。

NMD 途径中有两个重要的功能单位，一个是外显子-外显子连接点复合物(exon-exon junction complex, EJC)，一个是由人类上游移码突变体(human up-frameshift mutant, hUpf)蛋白组成的监视复合体。

EJC 是细胞选择特定mRNA 翻译成蛋白质的主要机制，在哺乳动物细胞中调控NMD、核mRNA 输出和翻译。EJC的核心是一个异四聚体，由Mago、Tsu/Y14、真核起始因子4AIII (eIF4AIII) 和Barentsz/MLN51 组成。晶体结构表明，eIF4AIII 与靶mRNA 结合，而MAGOH/Y14 异源二聚体通过抑制eIF4AIII 的ATP 酶活性来调控eIF4AIII[34,35]。由于premRNA 的剪接，EJC 蛋白复合物沉积在剪接体内含子上游20-24 核苷酸处，并被翻译的核糖体所取代。它由一个内层异四聚体核心(由eIF4A3、Btz、Y14 和Mago nashi 组成)组成，作为Upf3、Upf2 等蛋白的外壳结合平台，并稳定地结合直至成熟的mRNA 核蛋白颗粒(messenger ribonucleoprotein particle, mRNP) 输出至胞质，包括核输出、稳定性、转运、无意义介导的衰变和翻译。在这过程中，Y14 是NMD 所必需的蛋白质，它的作用是补充hUpf 蛋白到EJC 上，从而触发NMD[36]。但是，目前EJC 模型被提出来只用来解释哺乳动物的NMD，因为其他生物体要么缺少EJC(如酵母)，要么它们的EJC 蛋白不是NMD 所必需的(如秀丽隐杆线虫)[37]。

近年来，随着分子生物学的进展，人体发现NMD 与肿瘤发生发展有着十分密切的关系。有报道称，果蝇mago 和Y14 等EJC 蛋白，以及Srp54 剪接因子，在敏化条件下是Hedgehog (Hh)通路活性的修饰因子。Hh 分子是一种信号转导蛋白质配体，在动物的发育过程中控制细胞命运、增殖与分化。如果该信号通路表达异常，会引起肿瘤的发生与发展。mago 抑制可以改变Cubitus interruptus (Ci)的剪接模式来降低ci-155 转录因子水平，从而降低Hh 信号转导通路活性[38]。Salicioni[39]等发现人类RBM8 与候选肿瘤抑制因子OVCA1存在相互作用，RBM8 在人体广泛表达，尤其在睾丸、心脏、胎盘、脾脏、胸腺和淋巴细胞中等部位高水平表达，提示RBM8在控制肿瘤命运中起重要作用。肿瘤发生发展的微环境压力，包括缺氧、氨基酸缺乏、其他营养物质缺乏、血管系统不足等都可激活以内质网为中心的未折叠反应蛋白 (UPR)的表达水平[40]。无害的低水平压力不足以触发UPR，在组织培养细胞或小鼠中，UPF 缺失降低了UPR 激活阈值，延长了UPR 应答，说明NMD 正常情况下抑制了UPR。但是，如果所遇到的压力超过了细胞能够承受的阈值，就必须通过凋亡来终止， NMD 就发挥了作用[41]。Viswanathan[42]等发现MAGOH 降低会导致剪切过程中的内含子保留增加，RNA 监测异常，损害细胞的正常活力，从而引发凋亡或细胞死亡。因此，当细胞凋亡被触发时，NMD 被减弱，增加了细胞死亡的速率和稳健性，引起肿瘤发生。

3 展望

分子进化原理告诉我们：一个功能区间常常由于纯化选择(purifying selection)的存在而表现出序列上的保守性，其功能越重要，序列越保守。基因簇不仅享有共同的进化过程，而且保持了共同的一般功能，因其重要的生物功能而在自然选择的作用下呈高度的保守性[43]。如鼠类和蝇类蛋白平行进化同源性的存在几乎都依赖它们的同源结构域，这加强了这些功能域决定其特性的观点。线虫和果蝇在生殖过程中的相似性表明配子发生的许多方面都是保守的，这一基本的生物学过程也存在于其他多细胞动物中。

从以上综述可以看出，mago 和Y14 蛋白在各物种间保守表达，可见其功能非常重要。现有的研究结果使我们对mago和Y14 参与生殖发育调节和细胞调控尤其在NMD 中的重要作用有了初步的了解。随着各种功能基因组学研究方法的不断创新及运用，mago 和Y14 蛋白的功能将研究得更加透彻，以进一步揭示NMD 途径的功能和调控机制，并将阐明它们在肿瘤发生发展中所起的作用，为我们在基因翻译水平上研究正常细胞和肿瘤细胞、并且有可能为肿瘤的基因治疗甚至战胜肿瘤提供新的方法和思路。