朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3基因克隆及表达特征分析

丁 超，宋莉红，卜春亚

(北京农学院生物与资源环境学院/农业农村部华北都市农业重点实验室，北京 102206)

朱砂叶螨(Tetranychuscinnabarinus)别名红蜘蛛，俗称“红蛐”，属于蜱螨目叶螨科，为多食性害螨，主要寄主是瓜类、豆类等植物，广泛分布于中国各地[1]。因其具有较强的繁殖能力且近亲交配、生存领域小、世代周期短、对环境适应性强、且时常接触杀虫剂，导致其产生抗药性比其他农作物害虫更为严重[2]。目前全球市面上最主流的防治方法是依靠化学农药进行化学防治，其具有见效快、成本低、面积广等优点，常用的有炔螨特、阿维菌素、氟虫脲、哒螨灵、吡虫啉等[1]；该方法有一定的缺点，如易残留、毒性大，对人体产生危害，喷洒的同时对周围环境产生破坏。同时由于朱砂叶螨等害虫具有易产生抗药性的特点，极易造成后期难以杀死，需要加大农药的剂量，从而造成恶性循环。

几丁质脱乙酰基酶(CDA)是参与昆虫几丁质代谢的关键酶类，其主要作用是将几丁质脱乙酰基化形成壳聚糖，这种修饰可能有助于增强多种蛋白与几丁质特异性结合的亲和力[3]。几丁质是昆虫生长发育过程中不可或缺的多糖，对昆虫的外骨骼、表皮、围食膜的形成起到重要作用。几丁质脱乙酰基酶在昆虫的蜕皮和围食膜的形成过程中起到关键作用[4-6]。

自1984年初次在鲁氏毛霉(Mucorroxianus)的提取物中发现几丁质脱乙酰基酶以来，人们又陆续在昆虫、真菌、细菌中发现几丁质脱乙酰基酶的存在[7-10]。Guo等[11]在2005年首次在昆虫粉纹夜蛾的中肠中发现并鉴定其几丁质脱乙酰基酶，发现其在没有几丁质结合区域的情况下有很强的几丁质结合活性并与围食膜的特性相关。后来，Arakane等[12]在赤拟谷盗中发现多种几丁质脱乙酰基酶，通过对其性质和结构划分出详细的几丁质脱乙酰基酶家族(GroupⅠ-GroupⅤ)，GroupⅠ、GroupⅡ有3个保守区，GroupⅢ、GroupⅣ有几丁质结合结构域和乙酰基催化结构域，GroupⅤ只具有乙酰基催化结构域[13]。并通过RNAi的手段验证部分几丁质脱乙酰基酶对昆虫生长发育的影响。

目前研究表明哺乳动物和高等植物中并没有几丁质脱乙酰基酶，故而可以利用几丁质代谢相关生物防治药物去调控昆虫的生长发育和繁殖，从而达到防治害螨的目的，且对环境和人类的副作用小，符合绿色农业的理念。该研究旨在克隆朱砂叶螨TecCDA3基因并分析其表达特征，为阐明朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶家族奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 供试用昆虫与试剂

供试用昆虫为北京农学院农业农村部华北都市农业重点实验室培养的敏感品系朱砂叶螨，通过人工种植的白花芸豆进行饲养，未经任何特殊处理，温度26 ℃±1 ℃，相对湿度50%±10%，光照/黑暗为16 h/8 h，此为朱砂叶螨的最适生长环境。EasyPure©RNA Kit、TransScript©One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司；X5 High-Fidelity DNA Polymerase PCR Mix、M5 HiPer pTOPO-Blunt Cloning Kit、M5 HiPer Top10 Competent Cell购自北京聚合美生物科技有限公司；FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit、FastPure Plasmid Mini Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司；TB Green©Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)购自大连宝生物(Takara)公司。

1.2 朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3基因克隆

1.2.1 朱砂叶螨的培养 朱砂叶螨有4个生长时期，分别为卵时期、幼螨时期、若螨时期、成螨时期。用细毛刷挑取约1 000头生长状况良好的朱砂叶螨雌成螨到一盆新白芸豆叶上，将其放回养螨室进行为期24 h的产卵，使用体式显微镜观察产卵数量，若产卵数量较多且密集则将叶片上的雌成螨尽数挑下，使之只剩卵于其叶上，继续观察，约3 d朱砂叶螨由卵发育至幼螨，约5 d发育至若螨，约9～10 d发育至成螨。不同时期的螨均通过自然发育得到。将同一时间段所有螨均用细毛刷挑至0.02%的吐温20溶液中进行细分，卵与幼螨使用0.175 mm筛子筛得幼螨，幼螨与若螨使用0.225 mm筛子筛得若螨，若螨与成螨使用0.3 mm筛子筛得成螨。过筛后用清水轻轻冲净螨身上的吐温溶液，将筛子倒扣于干燥的干净吸水纸上吸干水分，通风干燥约2 min，待螨可以活动后用细毛刷收集最少10 mg同一时期的螨至1.5 mL离心管中，4个时期共计4个离心管。

1.2.2 朱砂叶螨总RNA提取 将1.2.1中的4个离心管快速置于液氮中，急速降温约30 s，用电动研磨器将组织研磨成粉末，参照EasyPure©RNA Kit说明书对朱砂叶螨进行总RNA提取。

1.2.3 第一链cDNA合成 参照TransScript©One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix说明书对朱砂叶螨总RNA进行反转录生成cDNA。

1.2.4 引物设计 根据前期获得的朱砂叶螨转录组数据，通过NCBI的Blast找到高同源性物种二斑叶螨，以其几丁质脱乙酰基酶基因为参照，设计5′引物和3′引物进行同源克隆，TecCDA3-F为5′-AATCACCACTGAATTTAGCCAAT-3′，TecCDA3-R为5′-TTGGTCAAAAGTGAGATTACTTG-3′。

1.2.5 基因扩增 以朱砂叶螨cDNA为模板进行PCR扩增(50 μL)，体系参照X5 High-Fidelity DNA Polymerase PCR Mix说明书。PCR扩增程序为预变性95 ℃，3 min；变性95 ℃，10 s；退火54 ℃，15 s；延伸72 ℃，1 min；34个循环；大延伸72 ℃，5 min。用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检验，对符合大小的产物进行纯化，纯化后连接至TOPO载体上，转化至Top10感受态细胞中，菌液PCR进行验证，对阳性克隆进行质粒提取并送交上海生工生物公司进行测序。

1.3 朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3基因特征分析

通过NCBI的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/home/analyze)进行基因开放阅读框的推导；将朱砂叶螨CDA的CDS区域翻译成氨基酸序列后，通过NCBI的Blast工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)软件进行氨基酸序列同源性比对，使用MEGA7.0系统发育树的构建，使用ML法进行发育树构建，使用Bootstrap=200的方法进行结果数据的计算；通过SMART(https://smart.embl-heidelberg.de)进行蛋白功能域的预测；使用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale)进行蛋白疏水区的分析。

1.4 朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3在不同生长时期的表达规律

1.4.1 不同生长时期朱砂叶螨的RNA提取和cDNA合成 使用全式金EasyPure©RNA Kit试剂盒分别对各个时期的朱砂叶螨进行RNA提取，然后通过全式金TransScript©One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒以提取的RNA为模板反转录合成cDNA。

1.4.2 实时荧光定量PCR 用Beacon Designer 7软件设计TecCDA3基因的RT-qPCR引物，同时设计一对β-actin基因为内参，引物见表1。

表1 TecCDA3荧光定量引物设计Tab.1 Design of RT-qPCR primers for TecCDA3

分别以朱砂叶螨4个时期的cDNA为模板，参照Takara公司的TB Green©Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)说明书对荧光定量体系进行配置，PCR反应条件为二步法PCR。95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循环。单次试验中每个样本设置3次重复，同时设置阴性对照，阴性对照重复2次。程序设置使用相对定量△△Ct法，CT值使用2-△△Ct法计算其相对表达量，设定EGG时期为参照，相对表达量为1，使用SPSS软件对数据进行显著差异性分析，采用单因素方差分析(ANOVA)并采用Tukey's HSD算法进行分析(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶TecCDA3基因克隆

以朱砂叶螨cDNA为模板扩增得到与预期大小相一致的基因，大小约为1.6 kb。通过NCBI的ORF Finder工具分析TecCDA3的开放阅读框，见图1。TecCDA3包含一个长度为1 611 bp的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，共编码536个氨基酸，以5′端的起始密码子ATG开始编码蛋白，TAA为其终止密码子，蛋白分子量为62.07 kD。命名为TecCDA3(Genbank：MK779705)。

2.2 TecCDA3氨基酸序列同源比对分析

使用NCBI的Blast工具进行筛选，得到多组高同源性物种的氨基酸序列，用MEGA7.0软件对二斑叶螨(Tetranychusurticae)、赤拟谷盗(Pseudostellacrassipes)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)的CDA3氨基酸序列与朱砂叶螨TecCDA3进行同源比较，得到图2。比对结果显示朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶与二斑叶螨具有最高的同源性；使用SMART在线工具对朱砂叶螨TecCDA3的氨基酸序列进行蛋白结构域分析，TecCDA3含有几丁质结合结构域(ChBD)，低密度脂蛋白受体结合结构域(LDLa)和多糖多乙酰基催化结构域(Polysaccharide deacetylase)。Group Ⅱ型几丁质脱乙酰基酶均含有这3种催化结构域，并且呈现高度的保守性。TecCDA3蛋白从第12个氨基酸到第31个氨基酸之间有明显跨膜结构，共计20个氨基酸，表明其为跨膜蛋白，但是其并不含有信号肽位点。

2.3 TecCDA3的疏水性分析

通过ProtScale在线软件在线对朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶的疏水性进行分析预测，结果如图3。当Score>0的得分时表示该区域为疏水性，当Score<0的得分时表示该区域为亲水性，得分绝对值越高表明相对的亲疏水性越高。TecCDA3的氨基酸序列中均含有亲水区域和疏水区域，且分布总体上来说较为均匀，但是可以明显看出处于Score<0的得分区域要多于Score>0的得分区域，故而总体上来说属于亲水蛋白，计算平均疏水性为-0.403，与预测的结果一致，为亲水性蛋白。

2.4 分子进化树构建

发育树主要选取包括朱砂叶螨在内的多种物种的几丁质脱乙酰基酶，如图4。通过发育树的构建可以看出，TecCDA3与同属蜱螨目的二斑叶螨的几丁质脱乙酰基酶亲缘性最高，由于高度的序列相似性，其遗传距离十分相近。命名为TecCDA3，除此之外可以看出朱砂叶螨的几丁质脱乙酰基酶与蜱螨目的物种亲缘关系最近，如柑橘全爪螨(Panonychuscitri)、二斑叶螨(Tetranychusurticae)，它们处于同一条分支上；与黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)等相对遗传距离较近；与家蚕(Bombyxmori)、中华稻蝗(Oxyachinensis)等相对遗传距离较远。通过构建的发育树可以明显看出几丁质脱乙酰基酶基因家族的分布，为GroupⅠ至GroupⅤ，其中TecCDA3属于Group Ⅱ。

2.5 TecCDA3基因在朱砂叶螨不同生长时期的表达规律

将得到的数据通过2-△△Ct法计算朱砂叶螨在4个生长时期相对表达量，结果通过Origin软件进行作图，见图5。朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶在4个生长时期(卵时期、幼螨时期、若螨时期、成螨时期)的mRNA丰度的相对差异，该试验使用的内参基因为β-actin，其作为看家基因在细胞中的表达量较为稳定。TecCDA3在朱砂叶螨各个生长时期均有表达，但是表达量之间具有显著差异，TecCDA3在成螨时期表达量达到最高，在幼螨时期表达量最低，在卵时期的表达量要高于若螨时期，整体呈现出一种先下降后上升的表达趋势。

3 讨 论

目前在中华稻蝗(O.sinensis)、赤拟谷盗(T.castaneum)、意大利蜂(I.bee)、黑腹果蝇(D.melanogaster)、冈比亚疟蚊(A.gambiae)、柑橘全爪螨(C.citris)、家蚕(B.mori)、云山卷叶蛾(S.budworm)、褐飞虱(Nilaparvatalugens)、柑橘木虱(D.citri)等多种昆虫中均发现了几丁质脱乙酰基酶。其中赤拟谷盗最高的含有9种亚型基因，但并不是所有昆虫都具备全部的9种亚型基因。这9种亚型被分为5个家族，这5个家族中目前研究最多的是Group Ⅰ，该家族基因被证实具有参与昆虫体内几丁质代谢的作用，影响昆虫胚胎表皮的形成和气管几丁质的排列[14]。对其余的4个家族目前研究较少。

几丁质脱乙酰基酶TecCDA3为亲水性蛋白，具有一个跨膜结构，无信号肽。由于不具备信号肽可能造成无法引导蛋白到达细胞含不同膜结构的亚细胞器内，导致其无法加工。发现其氨基酸序列中含有3种不同的结构域，分别为几丁质结合结构域(ChBD)、多糖多乙酰基催化结构域(Polysaccharide deacetylase)和低密度脂蛋白受体结合结构域(LDLa)，且具有高度的保守性。分子进化树分析可知，朱砂叶螨与二斑叶螨的亲缘性最高。根据几丁质脱乙酰基酶具备的3个保守区域数目以及同源比对结果将TecCDA3归类为Group Ⅱ家族。目前的研究表明赤拟谷盗TcCDA3在成虫的胸肌中特异性表达[13]。NlCDA3为褐飞虱的肠道特异性几丁质脱乙酰基酶，在褐飞虱的各个生长发育阶段均有较高的表达[15]。柑橘木虱DcCDA3在其外表皮和3日龄若虫中含量最高，且表达水平与20-hydroxyecdysone的催化有关[16]。该研究的TecCDA3与北京农学院农业农村部华北都市农业重点实验室先前研究的与控制蜕皮有关的TecCDA1和TecCDA2之间的表达量存在着显著差异，TecCDA1和TecCDA2均在卵时期有最高或较高的表达量，而TecCDA3则在卵时期相对表达量较低，在成螨时期表达量最高，这可能暗示其功能上的差异，其对朱砂叶螨是否具有影响蜕皮功能还有待进一步探究。该试验结果丰富朱砂叶螨几丁质脱乙酰基酶基因家族，为基于靶向杀虫基因的筛选提供理论和实践依据。