共刺激因子B7 同源体4 蛋白在胆囊腺瘤和胆囊腺癌中的表达

郭伟，陈小爽，王晓磊，展鹏远

胆囊腺瘤癌变率约1.5%，是公认的胆囊腺癌癌前病变。B7-H4 蛋白于多种恶性肿瘤中表达，许多研究揭示B7-H4 在多种人类实体肿瘤中过表达，表达水平与病人预后不良和临床转归差密切相关，推测其参与了肿瘤的免疫逃避。本研究运用免疫组织化学法（免疫组化），分别检测胆囊腺瘤和胆囊腺癌中B7-H4 蛋白的表达，对其在胆囊腺瘤恶变过程中有无意义进行探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取河南大学第一附属医院2005年6 月至2015 年6 月符合条件胆囊腺癌病例共58例；其中女性36 例、男性22 例；年龄范围为32～81岁，中位年龄为61岁；WHO 2010年版胆囊癌病理分型：腺癌（乳头状型）33例，腺癌（硬化型）13例，腺癌（管状型）7 例，腺癌（黏液型）5 例；高分化（Ⅰ级）12例，中分化（Ⅱ级）29 例，低分化（Ⅲ级）17 例；AJCC（美国癌症联合委员会）和UICC（国际抗癌联盟）联合制定的胆囊癌TNM 分期（2015 年）：其中Ⅰ期10例，Ⅱ期5 例，Ⅲ（A+B）期16 例，Ⅳ（A+B）期27 例。对照组选取同期胆囊腺瘤40 例。58 例胆囊癌病人的1 年生存率41.86%，2 年生存率25.58%，3 年生存率5.7%，中位生存时间6.5 个月。本研究中病例均得到病人或其近亲属知情同意，研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 纳入标准

①胆囊腺瘤病理明确；②胆囊腺癌病理明确；③临床资料及随访资料完整；④胆囊腺癌术前无抗癌措施。

1.3 主要试剂和实验方法

主要试剂：mouseB7-H4 MAb（克隆号297219），Rat IgG2B，美国R&D 公司（苏州瑞诺德生物科技有限公司分包）；通用型超敏S-P免疫组化染色试剂盒。

实验方法：采集标本玻片，同等条件免疫组化染色。玻片制作流程：10%甲醛溶液固定；石蜡固定后包埋；4 μm切片；乙醇脱水；二甲苯透明。

1.4 结果判定标准

阳性细胞为胞膜和（或）胞质中出现定位良好的黄棕色颗粒，且染色高于背景者。以磷酸盐缓冲盐水代替一抗作阴性对照。依据阳性细胞占比和染色强度判读结果：a 按染色细胞占比计算分数（1分＝阳性细胞数＜1∕3；阳性细胞数1∕3＜2分＜阳性细胞数2∕3；3分＝阳性细胞数≥2∕3）。b 按染色深浅记算分数（0 分＝无染色：浅黄染色记1分；棕黄染色记2分；棕褐染色记3分）。积分数＝a×b。阴性：积分数＝0。阳性：积分数＝0＜（+）≤积分数＝2；积分数＝2＜（++）≤积分数＝4；积分数＝4（+++）≤积分数＝9。

1.5 统计学方法

应用SPSS 17.0进行本研究数据分析。两指标间关联分析：采用四格表χ检验。多组资料间的两两比较：采用行×列χ检验。生存率统计分析：采用Kaplan-Mier，Log rank 检验。结果判读以α＝0.05（双侧）检验水准，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 B7-H4分别在癌旁正常组织、胆囊腺瘤和胆囊腺癌中的表达

免疫组化显示：B7-H4 蛋白主要染色于组织细胞的胞膜、胞浆和（或）胞核中。B7-H4蛋白在慢性胆囊炎、癌旁正常组织、腺瘤、腺癌组织中表达率分别为0.00%、0.00%、15.00%、67.24%。慢性胆囊炎（图1A）和癌旁正常组织（图1B）无表达；在腺瘤阶段以胞膜为主，同时也存在胞质表达（图1C）；在腺癌阶段同时存在核表达、胞质及胞膜表达（图1D）。

2.2 B7-H4 蛋白在胆囊腺瘤和胆囊腺癌中的表达

B7-H4 蛋白在胆囊腺瘤的阳性表达率15.00%（6∕40），在胆囊腺癌阳性率为67.24%（39∕58），差异有统计学意义（χ＝26.017，P＜0.05）。

图1 胆囊切除标本的共刺激因子B7同源体4蛋白的检测结果：A为慢性胆囊炎（SP×40）；B为癌旁正常组织（SP×40）；C为胆囊腺瘤（SP×200）；D为胆囊腺癌（SP×200）

2.3 B7-H4蛋白在胆囊腺癌分级中的表达

B7-H4蛋白在胆囊腺癌低-中分化组的阳性表达率69.44%（25∕36），高分化组的阳性表达率33.33%（4∕12），差异有统计学意义（χ＝4.907，P＝0.027）。

2.4 B7-H4蛋白在胆囊腺癌分期中的表达

B7-H4蛋白在胆囊腺癌TNM（Ⅰ+Ⅱ）中阳性表达率86.67%（13∕15），在胆囊腺癌TNM（Ⅲ+Ⅳ）中阳性表达率60.47%（26∕43），差异无统计学意义（χ＝2.379，P＝0.123）。

2.5 B7-H4蛋白在胆囊腺癌中阳性表达与相关影响因素的分析

B7-H4蛋白阳性表达在年龄和性别差异无统计学意义（P＞0.05）。B7-H4 蛋白阳性表达在伴胆囊结石、肿瘤长径和有无淋巴结转移中差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.6 生存分析

Kaplan-Meier生存分析，胆囊腺癌病例中B7-H4 蛋白阳性表达组中位生存期为26 月，95%CI：20.661～31.339，B7-H4蛋白阴性表达组中位生存期为22月，95%CI：6.359～37.641。Log-Rank（Mantel-Cox）显示：B7-H4蛋白表达阳性组与表达阴性组3年生存期差异无统计学意义（χ＝0.187，P＝0.665）。

表1 胆囊腺癌58例B7同源物4（B7-H4）蛋白表达结果与影响因素的分析∕例

3 讨论

胆囊腺瘤是公认的胆囊腺癌的癌前病变。目前认为女性、年龄≥50岁和直径≥1 cm是其癌变的高危因素，胆囊壁增厚和合并胆囊结石是其癌变的独立危险因素。但癌变机制尚不清楚。

B7 家族是唯一从抗原递呈细胞单向传递信号到T 细胞的刺激因子，对激活或者抑制T 细胞免疫应答十分重要。其中B7-H4 的基因组DNA 定位于第1 号染色体上，由6 个外显子和5 个内含子组成。B7-H4 mRNA 广泛分布于正常组织中，但通过免疫组化法检测正常人的肝、肾、胰腺、卵巢、肠道等组织中均未见阳性结果，表明正常的外周组织可能在翻译水平上对B7-H4的表达进行严密的调控，而在包括膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌、食管癌、宫颈癌、肺腺癌、喉癌、结直肠癌等多种人类实体肿瘤中过表达，且表达水平与病人预后不良和恶性转归密切相关，提示B7-H4可能在恶性肿瘤中的发生中发挥作用。作为免疫调节蛋白B7 家族一员，B7-H4 与特异性受体BTLA 分子结合，能显著抑制T 细胞增殖分裂，阻遏细胞周期连续进行，促进T细胞凋亡，从而在肿瘤免疫中起抑制作用。Choi IH 等研究显示B7-H4 在大多数正常组织细胞中不表达或低表达，相反在85%卵巢癌和31%肺癌组织中阳性表达，其研究表明：B7-H4 在正常外周组织的翻译水平上表达受到严格调控，B7-H4 可能在逃避肿瘤免疫方面发挥作用。Liu WH 等研究显示B7-H4 的异常表达可能使本来正常的巨噬细胞拥有了抑制功能，使其可能在膀胱尿路上皮细胞癌细胞逃避免疫系统的攻击中发挥一定作用。Meng Z等和廖林虹、于晓红研究亦显示B7-H4在多种恶性肿瘤中有很高的表达比例，而在正常组织中的低表达或缺失蛋白的表达。何涛等研究显示过表达B7-H4可导致肿瘤细胞侵袭及转移能力增加，并发现该过程可能与细胞的EMT转化PI3K∕AKT通路激活有关，同时也发现，B7-H4与CXCL-12趋化因子及其受体的转录及蛋白表达有关，B7-H4表达被下调后，细胞侵袭能力也随之下调。Zhang C 等发现B7-H4 能够抑制B7-CD28 的共刺激作用和抑制T细胞分泌IL-10和INF-1等因子。Abadi等发现，剔除B7-H4基因小鼠可显著抑制乳腺癌细胞的肺转移。以上证据表明，B7-H4可抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫应答，因此，B7-H4 可能作为治疗某些肿瘤尤其是高表达B7-H4 的恶性肿瘤的潜在靶点。

本研究亦显示：B7-H4 蛋白在胆囊腺瘤及胆囊腺癌中均有阳性表达，并且在胆囊腺癌中表达明显高于胆囊腺瘤；B7-H4 的蛋白阳性表达与胆囊腺癌的分化程度有关，其表达在低、中分化组与高分化组的阳性表达差异有统计学意义，但本研究并未观察到低、中分化组之间的差异，可能与本研究人数较少有关，今后增加研究人数，分析其相关性。B7-H4的蛋白阳性表达与胆囊结石、肿瘤长径及有无淋巴结转移密切相关，但与胆囊病理分期、年龄、性别无相关；胆囊腺癌中有无表达在3 年生存率方面差异无统计学意义。

综上分析，提示B7-H4 蛋白可能在胆囊腺瘤恶变为胆囊腺癌的起始发生中发挥作用，并使恶性程度升高，其机制有待我们进一步研究。