核苷酸切除修复交叉互补组基因1和人类X射线交错互补修复基因1 基因多态性与结直肠癌奥沙利铂疗效的相关性

李林子 ，李昌海，谢雄伟，刘晨晖，杨娥，韦智丹，廖秋霞

根据2015年中国癌症统计数据显示：结直肠癌（colorectal cancer，CRC）在女性中是继乳腺癌之后的第二大常见肿瘤，在男性中是继肺癌、前列腺癌之后的第三大常见肿瘤，严重威胁着人民群众的健康。当前对于CRC的治疗，化疗仍然是其主要手段，其中以铂类药物（主要为奥沙利铂）为基础的化疗方案是临床上治疗晚期CRC 常用的方案。然而，在临床应用中发现，铂类药物的疗效存在着个体化差异，这种差异与多种因素有关，其中个体的基因多态性就是其中主要因素，如DNA 修复能力增强、药物解毒增加、以及铂类DNA加合物增加等。

核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）途径可以快速修复铂类药物对肿瘤细胞中DNA所造成的损伤，改变肿瘤细胞对铂类药物的耐受性，进而影响铂类药物的化疗效果，该途径是目前唯一明确的人类细胞针对铂类药物所造成的DNA 损伤修复机制。其中核苷酸切除修复交叉互补组基因1（ERCC1）和人类X射线交错互补修复基因1（XRCC1）是NER系统中的最为重要的组成成分，两者参与铂类药物引起的DNA 损伤修复过程。因此，本研究将探讨ERCC1和XRCC1单核苷酸多态性（SNP）与接受以奥沙利铂为基础的化疗方案治疗晚期结直肠癌（CRC）疗效相关性，为指导晚期CRC的个体化化疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取荆门市第一人民医院2017 年11月至2019年4月收治的确诊为Ⅲ期和Ⅳ期（TNM分期）晚期结直肠癌化疗病人。

入选标准：（1）按照TNM分期，经病理组织学证实为Ⅲ期、Ⅳ期晚期结直肠癌病人；（2）具有可测量的实体病灶；（3）所有晚期结直肠癌病人之前未进行过姑息性治疗或既往使用过新辅助或辅助化疗（不含奥沙利铂）结束时间距离本次疾病复发时间超过了6 个月；（4）KPS 评分（Karnofsky 功能状态评分标准）≥60；预计生存时间＞3个月；（5）化疗前血常规、肝肾功能正常；（6）年龄≥18岁。本研究已报荆门市第一人民医院伦理委员会通过（批号201802021），入选病人均征得其本人或直系家属知情同意，并签署知情同意书。

1.2 研究方法

选取的所有CRC 病人均接受以铂类药物（主要为奥沙利铂）为基础的化疗方案（FOLFOX、CapeOX）进行化疗，其中采用FOLFOX方案（FOLFOX4方案27例，mFOLFOX6方案8例）有35例，采用CapeOX方案有60例，化疗3个周期之后进行疗效评价。

FOLFOX4 方案：第1 天奥沙利铂85 mg∕m静脉输注2 h；第1、2 天静脉输注亚叶酸钙200 mg∕m；第1天静脉推注5-FU 400 mg∕m，第2天22h持续静滴5-FU 600 mg∕m，每2 周重复，共24 周。mFOLFOX6方案：第1 天奥沙利铂85 mg∕m静脉输注2 h，亚叶酸钙400 mg∕m静脉输注2 h，5-FU 400 mg∕m静脉推注，然后5-FU 1 200 mg·m·d×2 d 持续静脉输注（总量2 400 mg∕m，输注46～48 h），每2周重复，共24周。CapeOX 方案：第1天奥沙利铂130 mg·m静脉输注2 h，第1～14 天卡培他滨1 000 mg·m·次，每日2次，每3周重复，共24周。所有病例均在化疗3个周期后对其进行疗效评价。

1.3 样本收集与评价标准

收集病人临床资料和血样样本并对其进行定期随访，评价化疗疗效及不良反应。

所有病人均至少完成3周期的化疗后评价疗效（肿瘤进展除外），对病人进行体格检查、实验室检查和影像学检查。按实体瘤的疗效标准（RECIST）分为：完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）和进展（PD），以CR+PR 为有效计算肿瘤控制率。化疗药物不良反应评价参照WHO（1981年）标准。

1.4 样本基因分型检测

本研究运用荧光染色原位杂交测序检测系统（TL998A型，西安天隆科技有限公司）对病人血液样本中白细胞进行基因分型检测。

抽取2 mL静脉血置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，富集血样中的白细胞，向其中加入100 μL PHARM-GENE 01 SNP分析保存液，用移液枪吹打混匀后室温静置30 min，各取1 μL经上述流程处理后的白细胞样本分别加入ERCC1 Asn118Asn、XRCC1 Gln399Arg PHARM-GENE 200 SNP 试剂，震荡混匀后置于实时荧光检测仪中进行基因分型检测。

试剂来源：所有基因分型检测试剂均购置于北京华夏时代基因科技发展有限公司。

1.5 统计学方法

采用检验分析样本基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。采用χ检验分析病人一般资料与晚期结直肠癌化疗疗效的关系；采用二元logistic 回归分析对ERCC1 Asn118Asn和XRCC1 Gln399Arg基因多态性与含奥沙利铂为基础的结直肠癌化疗方案疗效的关系（OR值，95%CI）进行分析。所有数据均用SPSS 17.0 软件进行统计分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因多态性分布

选取的95 例病例中，ERCC1 Asn118Asn 各基因型频率分别为：AA 型9 例（9.5%），AG 型32 例（33.7%），GG 型54 例（56.8%）；XRCC1 Gln399Arg 各基因型频率分别为TT 型4 例（4.2%），TC型41例（43.2%），CC型50例（52.6%）。经Hardy-Weinberg 遗传平衡定律检验，基因型ERCC1 Asn118Asn（χ＝1.64，P＞0.05）、XRCC1 Gln399Arg（χ＝1.54，P＞0.05）在这些样本群体中的分布符合遗传平衡，没有明显偏离分布，说明本研究资料具有群体代表性。

2.2 化疗疗效分析

2.2.1 临床资料统计和疗效相关性 CR、PR、SD、PD 分别为5、33、31、26 例，总有效例数38（CR+PR）例，总有效率为40.0%。所选病人性别、年龄、TNM分期、肿块部位（结肠部位、直肠部位）、化疗方案（FOLFOX4、mFOLFOX6、CapeOX）和化疗疗效均无明显相关性（P＞0.05），详见表1。

2.2.2 病人基因型和疗效相关性 选取的95 例CRC病例中，携带ERCC1 Asn118Asn GG、AG+AA基因型的病人化疗后有效率分别为51.9%（28∕54）和24.4%（10∕41），ERCC1 Asn118Asn AG+AA基因型病人化疗失败的可能性是GG 型的3.338 倍（OR＝3.338，95%CI为1.370～8.134，P＜0.05）；携带XRCC1 Gln399Arg CC、TC+TT 基因型的病人化疗后有效率分 别 为52.0%（26∕50）和26.7%（12∕45），XRCC1 Gln399Arg TC+TT 基因型病人化疗失败的可能性是CC 型之间的2.979 倍（OR＝2.979，95%CI 为1.257～7.060，P＜0.05）。详见表2。

表1 结直肠癌95例临床资料以及疗效分析

3 讨论

化疗的铂类药物在进入肿瘤细胞后能与肿瘤细胞中的DNA 结合，形成Pt-DNA 螯合物，进而导致DNA 链间或链内发生交联，从而引起DNA 复制障碍，抑制肿瘤细胞的分裂。NER 系统是人体中DNA损伤修复系统最为重要的组成部分，研究表明铂类药物引起机体中的DNA 损伤主要由NER 系统进行修复，因此，不同个体中NER系统的差异可能是影响铂类药物疗效存在个体化差异的重要因素。

ERCC1 基因是机体NER 系统中重要的DNA 损伤修复基因，其编码的蛋白能与着色干皮病基因组F（XPF）蛋白形成异源二聚体复合物（ERCCl-XPF），该复合物在对DNA 损伤位点进行识别和切除的过程中均起着关键性作用，能切除受损伤的寡核苷酸。然而，研究表明，人类机体中的ERCC1 基因存在着基因多态性，其中ERCC1 Asn118Asn（rs11615）位点的突变是该基因常见的SNPs，该位点突变可导致其表达的ERCC1蛋白水平下降，从而使机体中核酸切除修复能力显著下降，进而影响铂类药物疗效的差异，该基因位点的突变也是ERCC1基因与铂类药物疗效差异的主要研究位点。

表2 结直肠癌95例基因型和疗效分析（n＝95）

XRCC1是影响细胞对射线辐射敏感的基因，也是NER系统中另一个重要的碱基切除修复基因，其编码的XRCC1蛋白与DNA连接酶Ⅲ、多聚ADP核糖聚合酶（PARP）和聚合酶β形成复合物，该复合物参与碱基切除修复（BER），能修复铂类药物等内外因素诱导产生的DNA损伤，是BER通路的重要组成部分。研究表明，人体中XRCC1基因存在着基因多态性，其中XRCC1 Gln399Arg（rs25487）位点的突变研究最为广泛，该突变位于XRCC1基因的功能区，导致的氨基酸改变对XRCC1 蛋白功能的影响最大，进而影响XRCC1蛋白对受损DNA的修复能力，因此，理论推测该基因位点的突变将增强铂类药物化疗的疗效。

本研究结果表明，选取的95 例晚期CRC 病人中，ERCC1 Asn118Asn 和XRCC1 Gln399Arg 的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。病人的性别、年龄、结直肠癌分期（TNM分期）、肿块部位（结肠部位、直肠部位）和含铂类药物（主要为奥沙利铂）为基础的化疗方案疗效均无明显相关性（P＞0.05）。95 例CRC 病人中，携带ERCC1 Asn118Asn AA+AG 基因型病人化疗失败的可能性是GG 型的3.338 倍（OR＝3.338，95%CI：1.370～8.134，P＜0.05），携带XRCC1 Gln399Arg TC+TT基因型病人化疗失败的可能性是CC 型之间的2.979 倍（OR＝2.979，95%CI：1.257～7.060，P＜0.05）。提示ERCC1 Asn118Asn、XRCC1 Gln399Arg 基因多态性与CRC病人含奥沙利铂为基础的化疗临床疗效有显著相关性，此结果与国内外相关研究报道一致。

综上所述，机体NER 系统与含铂类药物（主要为奥沙利铂）为基础的联合化疗疗效差异存在密切相关性。ERCC1基因和XRCC1基因作为NER系统中的重要基因，其单核苷酸多态性（ERCC1 Asn118Asn、XRCC1 Gln399Arg）是不同个体对铂类药物化疗疗效差异的主要原因之一。检测ERCC1 Asn118Asn、XRCC1 Gln399Arg单核苷酸多态性有利于指导和预测晚期结直肠癌病人接受含奥沙利铂化疗方案的化疗疗效，为结直肠癌病人的个体化化疗提供理论依据。