不同产地佛手的香叶木苷及橙皮苷含量同时测定法

魏莹，肖莉，杨兰，廖思维，李艳平，张建武

佛手为临床常用理气药，具有疏肝理气，和胃止痛，燥湿化痰的作用，来源于芸香科植物佛手的干燥果实；常用于治疗肝胃气滞、胸胁胀痛、咳嗽痰多、胃脘痞满等症。佛手主要含有多糖类、挥发油类、香豆素类、酚酸类和黄酮类等多种生理活性物质。佛手中黄酮类成分除了橙皮苷外，还包括香叶木苷、胡萝卜苷、3，5，6-三羟基-3’，4’，7-三甲氧基黄酮、3，5，6-三羟基-4’，7-二甲氧基黄酮等。文献报道，香叶木苷具有良好的生物学活性，有促进细胞生长；诱导大鼠肝微粒体P450酶；抗凝血和抗静脉血栓形成；抗肿瘤等作用。中国药典以黄酮中的橙皮苷含量作为质量控制指标。但尚未见对佛手香叶木苷、橙皮苷同时测定方法的相关报道。本研究于2015年9月至2018年6月建立同时测定佛手药材中香叶木苷、橙皮苷的含量测定方法，可为更好地控制佛手药材的质量提供方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

昆山市超声仪器有限公司的超声波清洗器（KQ-500）；赛多利斯科学仪器有限公司的十万分之一电子天平（BT25S）；安捷伦科技有限公司的高效液相色谱仪（Agilent-1260）。

1.2 试药

佛手药材，经生药学杨兰老师鉴定其来源于芸香科植物佛手的干燥果实；对照品：香叶木苷（购于成都瑞芬思生物科技有限公司，批号D-005-161010），纯度≥98.5%，橙皮苷（自制，采用核磁共振碳谱，氢谱和电喷雾电离质谱鉴定，含量采用HPLC峰面积归一化法测定≥98%）；水为纯水（自制，pinchengPCJ-10 纯化仪）；乙腈HPLC 级；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

取香叶木苷、橙皮苷对照品适量，精密称定，分别置10 mL 容量瓶中，香叶木苷先用少量的二甲基亚砜（DMSO）将对照品完全溶解再加甲醇定容，制成香叶木苷对照品母液；橙皮苷用甲醇溶解，定容至刻度线，即得橙皮苷对照品母液。分别各取对照品母液1 mL，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液（香叶木苷、橙皮苷30.80、20.32 μg∕mL）。

2.2 供试品溶液的制备

精密称取佛手粉末（过五号筛）约1 g，于锥形瓶中，精密移取25 mL 甲醇，称定重量，以500 W，40 kHz频率超声提取1.5 h，放冷，再称定重量，甲醇补重，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液为供试品溶液。

2.3 色谱条件

DiamonsilC（250 mm×4.6 mm，5 μm）的色谱柱；乙腈（A）-0.1%醋酸水（B）（20∶80）的等度洗脱，1.0 mL∕min 的流速；285 nm 的检测波长；25 ℃的柱温；10 μL的进样量。色谱图见图1。

2.4 线性关系考察

精密称取对照品适量，加甲醇定容至刻度，摇匀，制得混合对照品母液（香叶木苷、橙皮苷分别为61.60，101.60 μg∕mL）。然后稀释成香叶木苷、橙皮苷含量分别为46.20，50.80；30.80，20.32；15.40，10.16；1.23，0.81 μg∕mL的混合对照品。按上述色谱条件进行测定，以进样量（ng）为横坐标（X），色谱峰峰面积为纵坐标（Y），得香叶木苷和橙皮苷的线性方程分别为Y＝0.824X+3.56（r＝0.999 7），Y＝1.537X+5.16（r＝0.999 8），线性范围分别为12.32～616.00，8.12～1 016.00 ng。

2.5 精密度试验

取香叶木苷、橙皮苷混合对照品溶液10 μL（香叶木苷、橙皮苷质量浓度分别为32.24，21.16 μg∕mL），在上述相同色谱条件下重复进样6 次，测定香叶木苷、橙皮苷的峰面积，计算峰面积RSD值分别为0.68%，1.12%，表明精密度良好。

2.6 重复性试验

称取川佛手（2 号）样品共6 份，各约1 g，精密称定，按上述方法制备供试品溶液，进行含量测定，外标法计算含量，结果香叶木苷的平均含量为0.07%，RSD 为2.20%；橙皮苷的平均含量为0.08%，RSD为2.60%；结果表明重复性良好。

2.7 稳定性试验

取川佛手（2号）样品约1 g，精密称定，按上述方法制供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，12 h 进样10 μL，测定其峰面积，香叶木苷、橙皮苷的峰面积的RSD 分别为2.41%、2.88%，结果表明供试品溶液在室温下12 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

精密称取（9号）佛手样品共6 份（9 号药材中香叶木苷、橙皮苷的含量分别为0.053%、0.029%），每份约0.5 g，分别精密加入含香叶木苷、橙皮苷浓度分别为0.264、0.145 mg∕mL的混合对照品溶液1 mL，参照上述方法制备样品溶液，再按上述色谱条件进行含量测定，结果见表1。

表1 准确度试验结果（n＝6）

2.9 样品含量测定

取14 批佛手样品各1 g，精密称定，分别制备供试品溶液，测定其含量，外标法计算含量，见表2。

图1 HPLC法测定佛手药材香叶木苷和橙皮苷的含量的色谱图：A为混合对照品；B为样品

表2 不同产地佛手中香叶木苷、橙皮苷含量（n＝4）

3 讨论

现今，关于佛手质量控制的报道很多，但未见其香叶木苷、橙皮苷同时测定的方法的文献报道。橙皮苷和香叶木苷均为黄酮类成分，具有良好的生物学活性。本研究建立两成分同时测定的方法，并用于不同产地佛手香叶木苷、橙皮苷的含量测定，结果表明，不同产地佛手中两者含量相差较大，且其中有两个批次广佛手（9号，11号）中橙皮苷含量低于2020年版《中国药典》的规定值0.03%，未达到药典标准。文献报道香叶木苷对照品用甲醇溶解，本研究参照文献采用超声和加热都不能使其完全溶解，故先加少量DMSO 待香叶木苷溶解后慢慢加入甲醇，超声制得香叶木苷对照品母液。在供试品溶液制备中，考察了加热回流和超声提取法分别在1.0、1.5、2.0 h提取时间的提取率，结果表明，水浴加热和超声提取1.5和2.0 h，提取回收率均在95%（提取1.0 h回收率在80%左右）。超声提取操作简便，最终采用超声提取的方法提取1.5 h。流动相组成考察了甲醇-水，甲醇-0.1%醋酸水，乙腈-水，乙腈-0.1%醋酸水，发现采用乙腈-0.1%醋酸水（20∶80）等度洗脱，两成分达到基线分离，且在20 min内完成分析。波长的选择方面，采用UV-1750 紫外可见分光光度计，于200～700 nm 波长范围内扫描香叶木苷、橙皮苷的对照品溶液，结果香叶木苷275 nm处有最大吸收；橙皮苷在283 nm处有最大吸收，由于两者洗脱时间接近，故不采用波长变化法进行测定。两者在285 nm处吸收均强，综合考虑选择285 nm为检测波长。

综上所述，本研究建立HPLC 法同时测定佛手药材中香叶木苷、橙皮苷的含量，方法操作简便、准确可靠和重复性好，可快速准确测定佛手药材中这两种成分的含量。