PD-1 及其配体PD-L1 与乳腺癌的研究进展

张艳珍， 胡蝶， 郑瑞， 章健， 浦春

（皖南医学院弋矶山医院检验科， 安徽 芜湖241001）

2018 年全球癌症统计， 乳腺癌的发病率和死亡率均居女性癌症发病和死亡的首位［1］。 在中国，女性最常见的癌症是乳腺癌， 其次是肺癌、 结直肠癌、 甲状腺癌及胃癌［2］。 乳腺癌的5 年、 10 年和15 年相对生存率分别为89%、 83%和78%［3］。乳腺癌可分为三种主要的临床相关亚型， 分别是管腔型， 表达雌激素受体（ER） 和／或孕激素受体（PR）； 人表皮生长因子受体-2＋（HER-2＋）；以及三重阴性， 即缺乏ER、 PR 和HER-2 的表达［4］。 传统上， 乳腺癌并不被认为是一种特殊的免疫原性肿瘤。 然而， 最近的研究表明， 一些侵袭性三阴性乳腺癌（TNBC） 具有免疫原性， 对化疗有抵抗力， 预后不良［5］。 程序性死亡因子1（PD-1） 及其配体（PD-L1） 在生理上调节适应性免疫系统的活动， 以限制过度的炎症过程， 从而防止正常组织损伤。 肿瘤细胞通过这种途径逃避宿主的免疫监视， 使其成为相关的治疗靶点［6］。尽管现在PD-1／PD-L1 在乳腺癌等实体肿瘤相关临床疗效方面取得了一定的成果， 但仍不完善；目前还是肿瘤免疫治疗的研究热点。 本文将围绕PD-1／PD-L1 在乳腺癌中相关表达， 免疫检查点阻断， 免疫治疗临床研究进展及PD-L1 实验室检测临床应用作一综述。

1 PD-1／PD-L1 的生物学特征

抑制性受体PD-1 （CD279） 于1992 年在Tasuku Honjo （2018 年诺贝尔生理学和医学奖获得者之一） 实验室被发现［7］。 PD-1 和PD-L1 （又称B7-H1 或CD274） 均为Ⅰ型跨膜蛋白， 属于免疫球蛋白（Ig） 超家族。 PD-1 的结构主要包括免疫球蛋白可变区（IgV） 样胞外结构、 疏水的跨膜区和包含两个酪氨酸信号基序的细胞质结构区［8］。PD-L1 含有IgV 和免疫球蛋白恒定区（IgC） 样胞外结构域、 跨膜区和不含典型信号基序的短细胞质尾［9］。 PD-1 广泛表达于活化的CD4＋、 CD8＋T细胞、 CD4＋调节性T （regulatory T cell， Treg） 细胞、 B 细胞和NK 细胞， 其主要功能是通过抑制T淋巴细胞和B 淋巴细胞的活化维持正常的自身免疫系统稳定状态［10］。 PD-1 的配体包括PD-L1 和PD-L2 （又称B7-DC 或CD273）。 PD-L1 在正常健康组织和恶性细胞中广泛表达， 而PD-L2 主要由抗原提呈细胞表达［11］。 PD-L1 与PD-1 的结合导致T 细胞活化和效应器功能的抑制， 其介导机制是酪氨酸磷酸酶向免疫突触的募集， 从而扰乱T细胞受体信号传导［12］。

PD-L1 是两种已知的PD-1 配体最佳表征，它可以通过肿瘤细胞、 T 和B 细胞、 巨噬细胞和树突状细胞表达［13］。 PD-L1 和PD-1 是参与免疫调节的PD 通路的关键成员。 PD-L1 与PD-1 相互作用诱导T 细胞抑制。 因此， PD-L1／PD-1 通路已成为免疫检查点抑制剂治疗的关键靶点［14］。 肿瘤细胞可以通过常见的致癌信号途径激活PD-L1的表达。 有研究显示PD-1／PD-L1 途径是癌细胞参与免疫逃避的途径［15］。

2 PD-1／PD-L1 在肿瘤中表达

在乳腺癌中， PD-L1 在不同亚型中的表达差异很大。 PD-L1 的表达在管腔A 型肿瘤中最低（3%～33%）， 在HER2 富集型肿瘤中居中（20%～34%）， 在 基 底 样或TNBC 中 最 高 （20% ～60%）［16］。 而一些化疗药物如紫杉醇已被证明可诱导PD-L1 的表达［17］。 Muenst 等［18］首次证实PDL1 表达与乳腺癌预后不良相关。

TNBC 的高侵袭性与不良预后不同于其他亚型， 是由于血管内皮生长因子（VEGF） 和其他促进肿瘤细胞生长和迁移的分子的高表达， 以及含有大量肿瘤浸润淋巴细胞 （tumor infiltrating lymphocyte， TIL） 和肿瘤相关巨噬细胞（tumorassociated macrophage， TAM）［19］。 有 研 究 表 明，TAM 正逐渐成为抗PD-1 和其配体（PD-L1） 药物活性的关键调节剂［20］。 TAM 可以通过Janus 激酶／信号转导子和转录激活子3 （JAK／STAT3） 和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K） ／AKT 信号途径分泌干扰素-γ （IFN-γ） 诱导PD-L1 的表达［21］。 而转化生长因子-β （TGF-β） 还可以通过诱导TAM 向M2 表型的极化增加其抑制活性， 并诱导PD-L1的上调， 从而导致肿瘤逃逸［22］。

有研究表明， PD-1 或其配体PD-L1 在肿瘤中的表达被认为是一种抑制性和／或耗尽性的免疫环境， 允许肿瘤逃避免疫介导的杀伤［23］。 PD-1阳性的免疫环境有助于癌症的发生［24］。 在乳腺癌中， PD-1 阳性TIL 的存在与乳腺癌的侵袭性肿瘤、 HER2＋状态和患者生存率低有关［25］。 Yeong等［26］研究发现， PD-1＋免疫浸润、 肿瘤细胞的PD-L1 表达和相关基因的表达与TNBC 的临床疗效的改善呈正相关。 Dill 等［27］研究发现， 肿瘤细胞和免疫浸润的PD-L1 表达在同一肿瘤内不同部位的不同核心部位是不同的， 这表明单个活检可能不能代表整个PD-L1 状态， 进一步研究肿瘤和免疫基质PD-L1 表达水平与PD-L1 抑制的临床反应之间的关系将是至关重要的， 尤其是在激素受体阴性的高级别肿瘤中。

3 乳腺癌肿瘤微环境

乳腺癌肿瘤微环境包括淋巴细胞、 巨噬细胞等浸润性炎性细胞。 其中， CD8＋T 淋巴细胞对肿瘤适应性免疫至关重要［28］。 三级淋巴结构是非淋巴组织在持续刺激下产生适应性免疫反应的重要功能临时位点， 结构上与次级淋巴器官类似， 其产生需要趋化因子的作用［29］。 在乳腺癌肿瘤微环境中， PD-1／PD-L1 的表达情况参见文献［30］。

髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells， MDSCs） 是一类在肿瘤微环境中抑制T 细胞活性的异质性髓系细胞［31］。 MDSCs 在B 细胞的增殖、 凋亡、 分泌抗体和细胞因子等免疫功能中也发挥着重要的调节作用。 Shen 等［32］研究表明，MDSCs 的存在降低了PD-1 的免疫检查点分子百分比， 同时增加了PD-L1 的表达， 进一步发现乳腺癌肿瘤微环境中MDSCs 诱导的PD-1-PD-L1＋细胞亚群具有免疫抑制作用， 证明了PD-1 和PD-L1 对B 细胞的调节可能是免疫治疗的重要靶点。

多聚ADP-核糖聚合酶（PARP） 通过诱导自身和其他靶蛋白的多聚ADP-核糖基化参与DNA碱基切除修复［33］。 PARP 抑制剂（PARPI） 可通过上调PD-L1 在乳腺癌细胞系和动物模型中的表达来调节肿瘤微环境， 阻断PD-L1 的抗体可使PARPI 处理的癌细胞对T 细胞杀伤重新敏感而减弱抗癌免疫， PARPI 和抗PD-L1 的联合治疗与单独使用两种药物相比显著提高治疗效果［34］。

IFN-γ 是一种在肿瘤微环境中具有拮抗作用的多效性细胞因子。 来自于T 细胞和NK 细胞的IFN-γ具有抗肿瘤作用， 而IFN-γ 水平的增加则诱导免疫抑制因子如吲哚胺2， 3 - 双加氧酶（indoleamine 2， 3-dioxyenase， IDO） 和PD-L1 的产生， 可能提供免疫逃逸机制并促进肿瘤生长［35］。

4 乳腺癌免疫检查点阻断

PD-1 是活化T 细胞表达的抑制性免疫检查点受体， 与肿瘤微环境中癌细胞或免疫抑制细胞表达的免疫抑制信号PD-L1 结合， 是肿瘤免疫逃逸的驱动机制之一［36］。 新的免疫检查点阻断策略正在临床试验中进行评估， 包括针对淋巴细胞活化基因3 （lymphocyte activation gene 3， LAG-3） 检查点， 单独或与PD-1／PD-L1 阻断联合使用。Burugu等［37］研究发现， 有50%以上的PD-1＋或PD-L1＋浸润的乳腺癌同时又有LAG-3＋浸润。 PD-1／PD-L1 阳性肿瘤与LAG-3 阳性之间的强相关性，正在一些转移性肿瘤的临床试验进行评估， 这表明针对这些免疫检查点标志物联合治疗具有潜在价值［38］。 有研究显示LAG-3 是活化T 淋巴细胞表达的细胞受体， 与T 细胞衰竭有关［39］。 临床前数据表明， LAG-3 阻断释放T 细胞效应器功能， 并与其他免疫检查点抑制剂如抗PD-1 协同作用［40］。有研究者发现美国食品药品管理局 （Food and Drug Administration， FDA） 批准的抗PD-L1 抗体，即阿替唑珠单抗（Atezolizumab， ATE） 与可上调PD-L1 细胞表面表达或最小化PD-L1 降解的化疗化合物相结合， 可协同增强T 细胞介导TNBC 肿瘤细胞的细胞毒性［41］。

微卫星不稳定性 （microsatellite instability，MSI） 是由错配修复（mismatch repair， MMR） 基因缺陷引起的一种表型。 研究显示高频微卫星不稳定性（MSI-H） 肿瘤对PD-1、 PD-L1 等免疫检测点蛋白有明显的上调作用， 对免疫检查点阻断具有敏感性［42］。 一种抗PD-1 免疫检查点抑制剂，pembrolizumab， 2017 年5 月被FDA 批准用于治疗MSI-H 或MMR 缺陷的不可切除或转移性肿瘤［43］。

5 免疫治疗应用价值

抗CTLA-4、 抗PD-1 和抗PD-L1 抗体被FDA 和欧洲药品管理局 （European Medicines Agency， EMA） 批准用于治疗广泛的肿瘤疾病，在早期和晚期情况下， 它们能引起持久的临床反应［44］。 抗PD-L1 药物ATE 联合纳米颗粒白蛋白结合型紫杉醇化疗已被批准用于PD-L1 阳性肿瘤转移性TNBC 的一线治疗［45］。

有研究表明， 用曲妥珠单抗（Trastuzumab）加抗PD-1 抗体联合治疗能显著提高小鼠HER2＋肿瘤的清除率［46］。 基于曲妥珠单抗的新辅助治疗方法可显著上调HER2＋乳腺癌患者TAM 的PD-L1和IDO 等免疫抑制标记物， 这与曲妥珠单抗反应不良有关［47］。 目前正在进行一项Ⅱ期、 全球性、随机、 双盲、 安慰剂对照研究， 评估在曲妥珠单抗-美坦新偶联物 （Ado-trastuzumab emtansine，TDM1） 中添加ATE 是否能进一步改善转移性HER-2＋乳腺癌患者的临床预后， 这些患者以前曾接受曲妥珠单抗和紫杉烷治疗 （ NCT 02924883）［48］。

D′Amico 等［49］研究了一种新的靶向HER2 的抗体-药物偶联物 （Antibody - drug Conjugate，ADC） 的治疗效果和免疫介导的机制， 该ADC 以强效蒽环类抗生素衍生物为有效载体（T-PNU），T-PNU 强烈激活T 细胞， 诱导IFN-γ 上调， 最后， T-PNU 与检查点抑制剂（ɑ-PD-1） 的结合显著增强了治疗后的肿瘤根除。 Dill 等［50］研究发现免疫抑制酶IDO 在高级别、 TNBC 中表达频繁，而在低级别、 激素受体阳性的乳腺癌中表达较少，而多数肿瘤PD-L1 阳性患者同时表达IDO， 表明IDO 可能在抗PD-1／PD-L1 免疫治疗抵抗中发挥作用， 在这种情况下， 双重治疗可能是有用的。有研究发现PD-L1 在成熟脂肪细胞中的表达明显高于前脂肪细胞， 核受体PPARγ 是促进脂肪生成的关键转录因子， 在脂肪生成过程中， 使用PPARγ 拮抗剂（GW9662） 抑制脂肪生成可选择性降低小鼠脂肪组织中PD-L1 的表达， 增强抗PD-L1或抗PD-1 抗体在同基因乳腺肿瘤模型中的抗肿瘤作用， 这为提高抗癌免疫治疗效果提供了一种先前未被重视的方法［51］。

6 PD-L1 实验室检测方法及检测意义

到目前为止， 许多生物标记物已经证明了其有效预测肿瘤反应的能力， 如PD-L1、 肿瘤突变负荷（TMB）、 MSI、 错配修复缺陷（dMMR）、 肿瘤新抗原负荷（TNB）、 TIL、 效应T 细胞基因标记、 T 细胞受体克隆性、 肠道微生物、 遗传特征等［52］。 PD-L1 有膜性形式（mPD-L1） 和可溶性形式（sPD-L1） 可供检测。 PD-L1 检测方法包括免疫组织化学技术（IHC）、 酶联免疫吸附测定（ELISA）、 定量免疫荧光 （IF） 和流式细胞术（FC） 等， IHC 在mPD-L1 检测应用最广泛， 而ELISA 在sPD-L1 占据主要地位［53］。

Kwa 等［54］阐明目前还没有PD-L1 生物标记物的标准化测试。 例如， 基于表达细胞类型（肿瘤细胞、 肿瘤浸润免疫细胞或两者） 的不同分析，以及mRNA 分析的不同评分方法， 在技术（IHC、DNA 微阵列和原位杂交）、 蛋白质或mRNA 水平上的分析、 IHC 的不同抗体以及使用不同临界值解释阳性的可变评分系统方面存在差异。 现已有诊断 性 抗PD - L1 克 隆22C3、 28 - 8、 SP142、SP263 已经获得FDA 批准应用于临床。 Barrett等［55］基于IHC、 FC 等技术， 在TNBC 样本中用流式细胞术对二倍体、 四倍体和非整倍体肿瘤细胞群的细胞核进行分类， 再进行全基因组拷贝数变异测量和寡核苷酸阵列分析， 研究表明基因组损伤可能有助于TNBC 肿瘤细胞中PD-L1 的过度表达。

综上所述， PD-1／PD-L1 轴的阻断已成为增强抗肿瘤免疫的治疗靶点。 虽然PD-L1 免疫组化评估已被批准作为辅助诊断试验， 但预测乳腺癌对免疫检查点抑制剂反应的生物标记物尚未完全优化， 需要进一步改进以优化治疗效果。