牵张成骨过程中相关细胞因子作用的研究

黄鹏程，王新卫

(1. 河南中医药大学，洛阳研究生培养工作部，河南 郑州 450000；2.洛阳正骨医院，河南 洛阳 471000)

0 引言

牵张成骨(distraction osteogenesis，DO)首先用于人体四肢延长手术。主要是采用一种拉伸装置，从截骨处施加一定的张力，使骨缺损区细胞的增生合成功能激活，达到促进组织再生的目的，促使骨骼伸长。20 世纪50 年代，Ilizarov 提出了“张力应激”规则，开创了牵张成骨的新时代，使骨延长广泛应用于外伤治疗骨缺损和创伤引起的肢体延伸。主要特征是一系列的细胞分子生物学变化，适当的机械牵张外力的刺激导致间质细胞向成骨细胞转化，最后，组织趋向愈合，其间涉及到各种细胞：间充质细胞、血管内皮细胞、前成骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞等。在此期间，间质细胞被复苏、定向，并通过外力同源扩张，然后分化成骨形成细胞，这是新骨再生的关键。

考虑到牵张成骨过程中易发生感染、关节挛缩、成骨不佳、肌肉萎缩等风险[1]，存在治疗周期过长的问题，作者对牵张成骨过程中的细胞因子相关作用进行了综述，以期从中找出最佳解决方案，具体综述如下。

1 相关细胞因子

1.1 骨形成蛋白家族(bone morphogenetic proteins，BMPs)

BMP 属于TGF-β 超家族的一分子，最早在20 世纪60 年代被发现，并由Urist 在诱导异位成骨的实验中进行了探索。它与许多骨生长因子中的骨诱导最密切相关。在骨骼肌肉生长过程中能够诱导骨髓间充质干细胞(BMSc)分化，促使其向成骨细胞表达[2]，加速骨成熟与矿化。

众多研究中，以BMP2、4、7 的研究最为常见。

1.1.1 BMP-2

BMP-2 是最重要的骨形成调节剂，在BMP 系统中它处于核心，不论在体内外都对干细胞、成骨细胞分化和骨形成具备诱导作用。

Chalmers 等[3]认为在骨与组织缺损区发生骨诱导的前提条件，必须存在三种情况：诱导剂；成骨前体细胞；合适的成骨环境。据此，我们有理由推测，在持续规律的机械牵拉刺激作用下，缺损区骨与软组织发生应激反应，诱导BMP 强烈表达，BMP 相关受体靶细胞作用于间充质类细胞或成骨前体细胞，促使细胞分化，在血供丰富的环境中，与其他细胞生长因子相互作用，加快骨组织再生修复。Raida 等[4]研究发现BMP- 2可能作为内皮祖细胞和间充质干细胞(MSCs)之间的桥梁，衔接二者之间，促进骨再生。Mizumoto 等[5]研究发现，通过对小鼠股骨缺损区局部注射BMP-2，不仅对于新骨生成具有加速作用，它还可以增加骨密度并改善新骨的生物力学特性。

1.1.2 BMP-4

BMP-4 在BMPs 中的作用与BMP-2 一样突出。BMP-4参与诱导成骨过程主要是通过牵拉刺激下的自身强烈表达来诱导成骨细胞和骨祖细胞的成骨分化[6]，它主要在软骨细胞、成骨细胞和间充质细胞中表达激烈，并激活碱性磷酸酶来促进骨钙素表达合成，进而增加矿化性骨小节的形成，以此来刺激骨的生长。

Pregizer 等[7]在研究中发现BMP-4 的转录在骨成熟后的骨骼重塑期间保持高度活化，表明BMP-4 对于骨发育和体内平衡是必需的。Miao Yu 等[8]在报告早发性骨质减少和骨质疏松症患者BMP-4 突变存在的研究中发现BMP-4 可能参与人类牙齿发育和骨骼稳态。

1.1.3 BMP-7

BMP-7 类似BMP-2，有强大的诱导骨骼能力，它能够保持软骨细胞表型，同时促进细胞增生以及细胞外基质蛋白多糖和II 型胶原合成[9]。有学者[10]认为BMP-7 在牵张成骨中作用过程是通过将骨折周围血肿内未分化的MSCs 向软骨细胞以及骨细胞诱导转化，然后经过钙质沉积生成新骨来实现的。

廖家成等[11]认为BMP- 7 诱导成骨的作用主要是通过诱导骨膜细胞转化成骨细胞来实现的，BMP-7 对诱导骨膜细胞增强碱性磷酸酶表达有突出贡献，而成骨细胞可以分泌含有众多碱性磷酸酶的基质小泡，随着基质小泡的破裂，局部碱性磷酸酶浓度升高，形成磷酸钙盐，最终促进钙化成骨。

1.2 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor , VEGF)

VEGF 是一种同源二聚体糖蛋白，它主要分6 部分：VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE 和 其 他。VEGF在牵张成骨中对破骨细胞和成骨细胞作用较大，并且正常VEGF 水平是维持正常骨重建所必需的[12]。在骨修复的炎症阶段增加的炎症因子，如前列腺素E1 和E2、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)，也诱导VEGF 表达[13]。VEGF 充当血管内皮细胞特异性有丝分裂原的角色，在促进内皮细胞生长的同时，也对血管生成有诱导作用。血管和骨细胞之间的实时通信能够确保细胞之间保持物理接近和功能依赖性[14]。

有学者[15]在大鼠牵张成骨模型中研究牵张成骨技术对骨骼形成的影响，研究发现牵拉中期牵张力刺激下产生的内源性VEGF 能诱导成骨细胞分化，VEGF 水平因应用牵张运动而增加，与增强骨骼形成密切相关。Han 等[16]研究发现VEGF 和MSCs 作用密切，MSCs 在缺血肢体中可通过分泌VEGF，将其作用于内皮细胞，或直接参与血管再生。此外研究发现随着牵张力的增加，牵张外力的刺激可促进VEGF 以及bFGF 的生成，这表明二者对血管神经的新生成具有促进作用，在缺损区血管生成部位不足的情况下，应用VEGF 不失为一种新的方法和思路。

1.3 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor , bFGF)

bFGF 以高度保守的单体肽的身份广泛存在于人体组织中，对胚胎发育、骨及软骨的修复重建意义较大。而且作为一种促分裂素，bFGF 还能将不同种类的间充质细胞诱导分裂表达，在骨折缺损早期它能够在肉芽组织中高度表达，在创伤早期加速血管内皮细胞的形成，促使组织自我修复。研究发现，在牵拉成骨过程中，通过持续规律的牵拉刺激，bFGF 活性得到增强，在成骨细胞和干细胞中表达强烈，并能够促使骨痂形成[17]。

Zhang 等[18]在兔下颌骨缺损研究中发现，bFGF 基因转染BMSCs 后表达增强，在兔下颌骨缺损模型中植入试验剂，结果表明与Bio-Oss 相关的bFGF 修饰的BMSCs 比传统方法更有效地促进新骨再生。Du 等[19]和Horikoshi-Ishihara 等[20]以及Ikeda 等[21]在研究中证实，bFGF 可明显促进干细胞增生，血管生成和神经再生。

1.4 转化生长因子 (transforming growth factor , TGF-B)

作为一种蛋白质多肽，在牵张成骨过程中，TGF-β 可以在牵引部位对成骨细胞进行趋化，并可以促进成骨细胞前体细胞的有丝分裂，增进软骨细胞以及成骨细胞的增生，加速间充质细胞的分化，增加细胞外蛋白质和胶原蛋白的合成，抑制其降解。此外，高浓度的TGF-β 对促进血管生成以及Ⅰ型胶原的合成作用突出。总之，TGF-β 在牵张成骨中的作用主要体现在：促进成骨细胞的分化，加速成骨细胞的成熟，促进骨再生。

TGF-β 在血小板和骨组织中含量丰富。其在人体只存在TGF-β 1、2、3 这三种，现在人们的主要关注点仍在TGF-β1方面。作为一种调节因子，TGF-β1 在骨折刚开始发生时，就能快速启动自我修复功能，通过促进BMSc、成骨细胞和软骨细胞的增生表达，来促使成骨细胞的合成，以加速骨赘的增生，促进骨折愈合[22]。Ueda A 等[23]在临床研究中证实TGF-β1、2、3 都在成骨细胞上表达，与骨折愈合相关，且只有TGF-β2 在骨膜上表达显示阳性，这充分表明了TGF-β2 的多效成骨的特点。

1.5 类胰岛素样生长因子 (insulin-like growth factor , IGF)

在骨吸收过程中，骨基质或破骨细胞释放出几种成骨因子，IGF 就是其中一员[24]。IGF 作为胰岛素样生长因子，对机体生长具有调节作用，同时具有胰岛素样代谢效应，目前有两种表现形式，以IGF-1 研究较多。

王阳等[25]认为IGF-1 在牵张成骨中主要作用于骨骺软骨板，能加速骨的纵向生长。另有学者认为IGF-1 主要与其受体酪氨酸激酶联合作用，上调蛋白激酶和c-Jun 氨基端激酶，与成骨细胞特异性转录因子(OSX)相作用，促进细胞增生分化，而且，IGF-1 可作为成骨细胞分化的头号标志物上调Ⅰ型胶原蛋白以及碱性磷酸酶MSCs 基因表达[26]，其成骨作用可通过加速碱性磷酸酶活性表达来增强成骨细胞的活性，促进成骨。

目前，更多的研究结果表明，IGF-1 可以促进牵张成骨过程中ALP 的活性，然而，作为外源性生长因子，IGF-1 的使用还未成熟，需要进一步探寻其发生发展机制[27]。

1.6 基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)

SDF -1 属于趋化因子蛋白家族，也称趋化因子CXCL12，它以小分子细胞因子的身份在骨与组织中起作用。主要有两种表现形式：SDF-1α/ CXCL12a；SDF-1β/ CXCL12 b。

SDF-1 在牵张成骨中的作用机制与骨折修复过程相像。牵拉刺激过程中，充质干细胞表面能够表达CXCR4，促使骨膜中SDF-1 表达増加，SDF-1 能特异性趋化CXCR4 表达阳性的MSCs，参与骨组织再生修复。周恩瑜等[28]在大鼠缺损模型中，通过免疫组织化学检测和酶联免疫吸附测定，研究SDF-1 在牵张成骨新骨缺损中的表达及其对牵张成骨作用机制，初步研究结果示：随着牵张的逐渐进展，SDF-1 的表达在成骨细胞和微血管周围逐渐增加，对照组骨折中骨赘的表达显著高于对照组。

1.7 神经生长因子 (nerve growth factor , NGF)

NGF 在神经营养素家族中位居首位，它对中枢神经系统和周围神经系统都具备调控功能，是一种调节多种神经细胞生长和发育的蛋白质。

骨折修复重建过程中需要多方面协作参与，神经生长作为重要的一环，NGF 在骨折愈合中的作用显得越发重要[29-30]。目前对于NGF 在牵拉成骨中的作用主要从促进BMP-2 诱导成骨方面阐述。Chaoyong 等[31]认为神经纤维生长与骨折愈合关系紧密，在牵张刺激下，NGF 能诱导缺损局部神经纤维生长，使神经肽类物质局部释放、局部血供增加，调节炎性细胞和骨愈合相关基因，促进骨诱导。姚建华等[32]证实骨组织中有神经纤维存在，验证了Chaoyong 等人的观点。

有学者[33]在试验中将NGF 局部注射在在骨缺损断端，随后观测结果显示骨痂生成速度加快，质量明显增加，证实了NGF 在促进骨折修复方面的突出作用。

1.8 金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinase , MMPs)

牵张成骨过程中MMPs 的运行机制尚未明确，国外研究显示在骨与软骨的重塑过程中，MMPs 通过破骨细胞聚集、成骨细胞存活促进骨吸收和形成，因此，它们被作为反映骨再生和组织重塑早期生物标志物[34]。

MMPs 通过分解ECM 成分，从细胞膜上脱落生物活性分子或蛋白质修饰它们参与骨代谢和骨发生[35]。目前MMPs 研究最多的是MMP10。Reyes 等[36]在小鼠颅骨局部缺损模型研究中研究发现，MMP-10 在与BMP-2 联合使用的情况下，可以加速骨愈合和提高矿化速率。

1.9 一氧化氮合酶(nitric oxide synthase , NOS)

NOS 能够以产生NO 或通过释放生长因子的方式来促进骨折愈合。eNOS 和iNOS 隶属于NOS 的三种异构体之中的两种。eNOS 大部分在细胞膜上表达，常见于血管内皮细胞。iNOS 大部分在细胞质中表达，常见于炎症细胞，如白细胞。eNOS 与iNOS 在牵张成骨过程中相互制约，i NOS 随eNOS的减少而增加，两者共同作用于骨形成和骨改建。iNOS 合成的众多NO 对于成骨细胞增生有克制作用，而且还能够引导其分解代谢，对破骨细胞机能有阻碍作用。

吴巍等[37]在兔下颌牙实验过程中，通过免疫组化检测后发现：TGF-β1 在牵张成骨过程中对eNOS 起调控作用，成正相关，通过对eNOS 调节来实现对i NOS 的调控，i NOS 又通过调控NO 浓度对TGF-β1 产生反作用，进而促进新生骨生成，促使骨折创面愈合。

2 不足与展望

牵张成骨技术自临床实际应用以来，以其独特的成骨理念和创新的手术方式受到了临床医师的一致推崇，其相关成骨理念直到现在仍然走在世界的前列，然而社会需要进步，技术同样需要革新，在科技社会日益发展的今天，医学事业的发展也在稳步前进，我们需要继承发展，开拓创新。临床实践证实，骨缺损区骨、软骨的生长以及血管神经的再生重建需要多种生物细胞因子参与，在单一的刺激下，仅能收到一定的效果，但却缺乏显而易见的临床疗效，我们有理由相信，在应用多种细胞因子及合理载体前提下，打造完整的信号通路，实现细胞分子的有机重建，这才是骨再生成功的关键。