3岁以下哮喘患儿粪便肠道菌群观察

徐伟，盛伟松，董娜，薛娟，朱丹荣，钱娟

南京医科大学第二附属医院，江苏南京 210011

肠道是人体质量要的免疫器官，肠道菌群对免疫系统具有重要影响，种类繁多的菌群对机体来说也是丰富的非自身性抗原，一方面机体对肠道菌群有互利共生作用，另一方面机体存在免疫防御机制，防止肠道菌群感染机体。同时肠道菌群可刺激增加树突状细胞的耐受性，通过相互作用，介导并促进T细胞向Th1分化[1-2]。有研究显示，梭状芽孢杆菌和脆弱拟杆菌能够刺激调节性T细胞分泌IL-10，还可抑制IL-17的分泌，同时还可直接降低免疫球蛋白IgE的分泌[3]。目前，幼儿哮喘发病机制尚未完全明确，多数学者认为与细胞因子、免疫功能密切相关。有临床研究提示，儿童肠道菌群的变化与哮喘有关，不同种类肠道菌群可能通过影响免疫功能促进或抑制哮喘发生[4-6]。国内少有学者对患儿肠道菌群情况与哮喘进行相关性研究。本研究观察了3岁以下哮喘患儿粪便肠道菌群变化，并分析其对外周血辅助T细胞及血清炎症因子的影响，旨在为哮喘患儿的临床诊治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年1—12月南京医科大学第二附属医院收治的3岁以下哮喘患儿50例[观察组，其中发作期患儿(出现气促、胸闷等临床表现，肺功能检查提示第一秒呼气量及呼气峰流速明显降低，少数患儿伴有严重低氧血症)21例，缓解期患儿(无气促、胸闷等临床表现，肺功能检查提示第一秒呼气量及呼气峰流速≥80%正常值，持续时间>4周)29例]，男29例，女21例；年龄(23.73±3.48)个月；喂养方式为纯母乳23例，纯奶粉13例，混合喂养14例；体质量(13.18±3.20)kg；生产方式为剖宫产23例，顺产27例。另选同期健康体检儿童50例(对照组)，男30例，女20例；年龄(23.19±4.82)个月；喂养方式为纯母乳24例，纯奶粉11例，混合喂养15例；体质量(13.28±2.86)kg；生产方式为剖宫产21例，顺产29例。纳入标准：①观察组患儿诊断符合儿童哮喘的诊断标准[7]；②年龄<3岁；③生长发育健康；④对照组为儿童保健评估为健康的3岁以下患儿。排除标准：①近1个月内服用抗生素或肠道菌群制剂者；②应用激素类、免疫抑制剂等药物者；③合并有其他系统过敏性疾病者；④近1个月内非哮喘疾病引起胸闷、咳嗽等疾病者；⑤无法配合研究的患儿；⑥对照组幼儿在研究期间诊断过敏性疾病者；⑦合并严重肝肾疾病者。本研究已经通过我院伦理委员会批准，所有入组幼儿均由监护人签署知情同意书。两组一般资料无统计学差异，具有可比性。

1.2 粪便肠道菌群检测 收集粪便标本于无菌干燥瓶内，取1 g大便标本，加入9 mL磷酸缓冲盐溶液，摇荡至少5 min充分混匀，在离心机中以1 500 r/min的转速离心5 min，提取上清液，重复操作3次，在离心机中以9 000 r/min的转速离心3 min，待沉淀后以磷酸缓冲盐溶液清洗4次，加入0.1 mL蒸馏水至悬浮，加入1%TritonX-100使细菌壁破碎，释放出DNA，持续煮沸5 min，放入冰水中冷却。选取荧光定量聚合酶链式反应(PCR)试剂盒进行检测，引物由重庆泽恒生物技术有限公司合成，大肠杆菌：上游序列5′-GATACTGGCTAAGTACGAGCTC-3′，下游序列5′-CAGTTTGCAGGAGTCGCACT-3′,共扩增200 bp。双歧杆菌：上游序列5′-CGTGATGCCTGACTGGAGTA-3′，下游序列5′-CTGATGCCGACTTAGCGTCGCA-3′，共扩增95 bp。PCR反应条件：100 ℃、45 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40个循环；72 ℃、10 min。采用2-ΔΔCt的计算方法算出目的基因相对表达量，并计算双歧杆菌与大肠杆菌的比值(B/E)。

1.3 外周血辅助T细胞检测 ①Th1、Th2：选择100 μL的全血标本，以1∶1比例用RPMI1640进行稀释，添加10 μL刺激剂，在5%CO2、37 ℃的培养箱中培养4 h。培养后混匀，添加CD3-PC5及CD8-PC7各10 μL，在室温条件下，避光孵育15 min；添加固定液100 μL；在室温条件下，避光孵育15 min；添加3 mL的磷酸缓冲盐溶液，以1 200 r/min离心5 min，弃上清液。管中添加100 μL破膜和溶血液，同时管中加入10 μL的IL-4-PE以及IFN-γ-FITC，在室温条件下，避光孵育15 min。各个管中添加3 mL磷酸缓冲盐溶液，在以1 200 r/min的速度离心5 min，弃上清液，0.5 mL磷酸缓冲盐溶液重悬细胞，在机上进行检测，每次对每个样本检测10 000个细胞。②Treg：取100 μL的全血标本，添加CD4-FITC及CD25-PE刺激剂10 μL，在4 ℃下避光孵育30 min，添加1 mL氯化铵红细胞裂解液裂解10 min，以磷酸缓冲盐溶液洗涤3次，洗涤时转速为1 200 r/min，时间为5 min；以1 mL Perm/Fixation缓冲液穿膜45 min，洗涤后加入鼠抗人Foxp3单克隆抗体，在4 ℃条件下避光孵育30 min。洗涤2次后以300 μL流式细胞染色缓冲液重悬，同时上FACSCanto进行检测。应用BDFACSDiva软件对数据进行分析，算出细胞数中Foxp3+细胞的百分比。每次对每个样本检测10 000个细胞，随后计算Th1、Th2、Treg的百分比及Th1/Th2比值。

1.4 血清炎症检测 取ELISA试剂盒，放至室温，在孔内加入样本、标准品，对照孔不加，在37 ℃条件下孵育30 min，洗涤3次。每孔内添加100 μL的酶标记抗体，在37 ℃条件下孵育40 min，洗涤3次。每孔内添加50 μL的酶底物，置于室温条件下暗盒内进行显色10 min。每孔内添加50 μL的终止液以终止反应。选择酶标仪在450 nm下读取OD值，绘制标准曲线后，计算IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IFN-γ水平。

2 结果

2.1 两组粪便双歧杆菌、大肠杆菌数量及B/E比较 粪便双歧杆菌、大肠杆菌数量及B/E比较见表1。

表1 两组粪便双歧杆菌、大肠杆菌数量及B/E比较

2.2 两组外周血Th1、Th2、Th1/Th2、Treg水平比较 外周血Th1、Th2、Th1/Th2、Treg水平比较见表2。

表2 两组外周血Th1、Th2、Th1/Th2、Treg水平比较

2.3 两组血清IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平比较 血清IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平见表3。

表3 两组血清IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平比较

2.4 观察组患儿肠道菌群变化与免疫功能的相关性 观察组B/E与Th1/Th2、Treg呈正相关(r=0.743、0.787，P均<0.05)，发作期B/E与Th1/Th2、Treg呈正相关(r=0.889、0.779，P均<0.05)，缓解期B/E与Th1/Th2、Treg无相关性(r=-0.248、0.156，P>0.05)。

3 讨论

近年来，幼儿哮喘的发病率明显升高，影响幼儿的生长发育。哮喘的病理特征是气道黏膜内大量炎性细胞的浸润，进而合成并释放大量的炎症介质，导致患儿气道黏膜内炎症发生引起哮喘[8]。目前，在临床上多数3岁以下幼儿哮喘症状表现不明显，往往缺乏典型症状表现，造成了一部分3岁以下幼儿在发病早期或者症状不典型时诊断较为困难，同时还有一些并发症可能会影响哮喘的诊治。哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，尤其是对于处在生长发育期的幼儿来说，可能会对3岁以下幼儿的生长发育产生不利影响。3岁以下幼儿临床症状无法真实准确反应呼吸道的炎症水平，而寻找有效的检验指标反映临床症状有重要意义。

肠道菌群能够增强幼儿免疫应答水平，能够促进T细胞分化，同时还可以刺激免疫细胞产生炎症因子，机体主要通过几种方式对肠道内的细菌产生作用；一是肠杯状细胞的上皮表面存在粘液层，能够组织细菌渗透；二是上皮细胞内分泌的凝集素能够有效限制细菌渗透；三是少数细菌能够到达肠固有层，在到达固有层后，会被树突状细胞呈递至B细胞，B细胞再分化为浆细胞进而分泌特异性IgA发挥作用。同时有研究显示，肠道细菌能够影响巨噬细胞等的代谢途径，进而增强巨噬细胞的功能，促进肿瘤坏死因子-α以及IL-10的分泌[9-10]。本文结果显示，观察组双歧杆菌及B/E低于对照组，观察组发作期患儿双歧杆菌以及B/E低于缓解期患儿，推测哮喘发生与双歧杆菌的数量减少有关。肠道菌群在患病幼儿与健康幼儿也存在差异，在土耳其的一项以0～3岁儿童作为对象的研究中，发现哮喘患儿的双歧杆菌数量明显低于正常儿童[11]。而ZHU等[12]对小鼠肠道菌群的功能进行基因表达谱分析，结果提示小鼠肠道菌群的分布与炎症反应相关。

在对T细胞亚群的分析中，观察组外周血Th1、Th1/Th2以及Treg明显低于对照组，Th2高于对照组；观察组发作期患儿外周血Th1、Th1/Th2以及Treg低于缓解期患儿，发作期患儿外周血Th2高于缓解期患儿。提示在哮喘儿童中存在T细胞免疫水平的异常，主要为降低Th1、Treg的水平，提高Th2水平，破坏了Th1/Th2的平衡。QIAN等[13]对早期小鼠哮喘模型进行研究显示，发现早期小鼠哮喘模型存在Th1/Th2的失衡，支持本研究结果。本相关性分析显示，观察组及观察组发作期患儿外周血B/E与Th1/Th2、Treg均具有相关性。说明在三岁以下哮喘患儿中，肠道菌群情况能够影响哮喘病情和免疫功能，其机制可能为哮喘患儿中，双歧杆菌数量降低，促进Th2细胞分泌IL-4、IL-5，抑制Th1细胞分泌IL-2、IFN-γ。刘钢等[14]对儿童哮喘与幽门螺杆菌感染情况进行了研究，提示幽门螺杆菌感染后会致使免疫系统功能紊乱，促使哮喘症状加重，结合本研究，胃肠道是相连接的，哮喘患儿肠道内的菌群有差异，也会导致患儿哮喘的发生，支持本次结果。

本研究还对相关的炎症因子进行了研究，结果显示观察组血清IL-1、IL-4、IL-5水平明显高于对照组，血清IL-2、IFN-γ水平明显低于对照组；观察组发作期患儿血清IL-1、IL-4、IL-5水平明显高于缓解期患儿，血清IL-2、IFN-γ水平明显低于缓解期患儿。分析其原因可能为IL-1是巨噬细胞产生，参与多个免疫反应，能够促进气道内中性粒细胞的浸润，激发缓激肽引起的气道高反应，同时还会增加其他趋化因子的分泌；IL-4、IL-5是Th2分泌的，IL-4可促进IgE的分泌、肥大细胞增长，IL-5可诱导趋化及激活嗜酸粒细胞，结合上述结果Th2细胞数量增加，进而致使哮喘患儿IL-4、IL-5分泌增加；Th1则分泌IL-2、IFN-γ，参与介导细胞免疫过程，是介导Ⅳ型变态反应的重要炎症因子，上述结果也提示哮喘患儿中Th1细胞水平降低，因此IL-2、IFN-γ分泌水平也相应减少。与多个研究结果相似[15-17]。

总之，在3岁以下哮喘患儿中，肠道菌群存在双歧杆菌水平降低，免疫功能下降，炎症因子水平异常，调节肠道菌群可能会有助于预防治疗3岁以下幼儿哮喘。