宫颈鳞癌组织中miRNA-451、c-myc、E-cadherin、Vimentin的表达变化及其意义

李雪，伍艳平，周铁军，龚莉

1西南医科大学附属医院，四川泸州 646000；2宜宾市第二人民医院

宫颈癌发病率居妇女恶性肿瘤第二位，且呈逐年上升趋势[1]，晚期患者生存和预后情况不容乐观。因此，寻找宫颈癌转移、复发的关键机制和调控靶点，并对其进行预防和治疗十分重要。微小RNA-451(miRNA-451)属于非编码RNA，是转录后调节的重要调控子，在多种肿瘤中存在异常表达，其表达与肿瘤发生和转移有一定关系[2-5]。c-myc是myc家族中的主要成员，是较早发现的癌基因之一[6]。c-myc被认为是细胞增殖、生长、分化和凋亡的重要调节因子，在许多肿瘤中被激活，蛋白产物表达升高，其表达和活性受miRNA的调控[7]。上皮间质转化(EMT)是肿瘤发生发展的重要过程，肿瘤细胞通过上皮表型[如E-钙黏蛋白(E-cadherin)]的丢失和间质表型[如波形蛋白(Vimentin)]的获得增加迁移、侵袭能力。本研究观察了宫颈鳞癌组织中miRNA-451、c-myc、E-cadherin、Vimentin的表达变化，并探讨其意义。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2015年1月—2016年1月西南医科大学附属医院病理科存档的宫颈鳞癌组织蜡块61例份，患者年龄31～62(45.88±6.56)岁，其中≥50岁20例、<50岁41例；依据国际妇产科联盟(FIGO)的宫颈癌分期：Ⅰ期47例，Ⅱ期14例；病理分型：角化型鳞癌21例，非角化型鳞癌40例；淋巴结转移17例，无淋巴结转移44例。所有病例均经病理确诊，且术前均未接受放化疗等抗肿瘤治疗。另选癌旁宫颈上皮内瘤变(CIN)组织蜡块30例份和正常宫颈组织蜡块20例份作对照。本研究征得患者及家属知情同意并签署知情同意书，并获得西南医科大学附属医院伦理委员会批准。

1.2 组织miRNA-451、c-myc、E-cadherin、Vimentin检测方法 ①miRNA-451：采用原位杂交法，按照原位杂交试剂盒说明书进行操作，主要步骤为石蜡组织标本连续切片(6～8 μm)，后脱蜡，3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶活性，蛋白酶处理后1%多聚甲醛室温固定10 min；滴加20 μL预杂交液38～42 ℃孵育2～4 h，滴加20 μL杂交液38～42 ℃过夜；SSC严格浸洗(2×SSC 5 min、2×SSC 5 min、0.5×SSC 15 min、0.2×SSC 15 min，37 ℃)，封闭液37 ℃孵育30 min，滴加生物素化地高辛及SABC分别在37 ℃条件下孵育60 min及30 min后，DAB显色(显微镜下控制显色时间)，苏木素复染，酒精脱水、二甲苯透明后、中性树脂封片。结果判定标准：以5个高倍视野下miRNA-451阳性细胞的计数来判断：<10%为阴性(-)，10～50%为阳性(+)，>50%为强阳性(++)；+、++记为阳性表达[8]。②c-myc、E-cadherin、Vimentin：采用免疫组化法检测，用Envision两步法，按照检测试剂盒说明书进行操作，主要步骤：石蜡组织标本连续切片(4～6 μm)后脱蜡，通过柠檬酸液在高压蒸汽条件下修复抗原，3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶活性；滴加一抗(稀释浓度：c-myc 1∶100，E-cadherin 1∶100，Vimentin 1∶100)并在37 ℃湿盒中孵育2～3 h，滴加Envision试剂并在室温下孵育2 h；DAB显色(显微镜下控制显色时间)，苏木素复染，酒精脱水、二甲苯透明后、中性树脂封片。按阳性细胞所占比例及染色强度计分：a.阳性细胞百分数：无阳性细胞为0分，>0～≤10%为1分，>10%～≤50%为2分，>50%～≤75%为3分，>75%为4分；b.细胞染色强度：无染色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分；最终评分为两项得分相加,<3分为阴性表达，≥3分为阳性表达[9]。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈鳞癌、CIN、正常宫颈组织中miRNA-451、c-myc、E-cadherin、Vimentin阳性率比较 宫颈鳞癌、CIN、正常宫颈组织中miRNA-451阳性率分别为16.4%(10/61)、36.7%(11/30)、80.0%(16/20)，c-myc阳性率分别为88.5%(54/61)、60.0%(18/30)、10.0%(2/20)，E-cadherin阳性率分别为55.7%(34/61)、70.0%(21/30)、95.0%(19/20)，Vimentin阳性率分别为67.2%(41/61)、46.7%(14/30)、20.0%(4/20)，两两比较，P均<0.05。

2.2 miRNA-451、c-myc、E-cadherin、Vimentin表达与宫颈鳞癌临床病理参数的关系 miRNA-451阳性表达与宫颈鳞癌病理分型、淋巴结转移有关，c-myc阳性表达与宫颈鳞癌临床分期、年龄有关，E-cadherin、Vimentin阳性表达均与宫颈鳞癌临床分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)。

表1 miRNA-451、c-myc、E-cadherin、Vimentin表达与宫颈鳞癌临床病理参数的关系

2.3 宫颈鳞癌组织中miRNA-451、c-myc与E-cadherin、Vimentin表达的相关性 宫颈鳞癌组织中，miRNA-451与E-cadherin表达呈正相关(r=0.305，P<0.05)，与Vimentin表达呈负相关(r=-0.351，P<0.05)；c-myc与E-cadherin表达呈负相关(r=-0.321，P<0.05)，与Vimentin表达呈正相关(r=0.406，P<0.05)；miRNA-451与c-myc表达呈负相关(r=-0.257，P<0.05)。

3 讨论

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，根据组织起源不同，可以分为鳞状细胞癌、腺癌等病理类型，宫颈鳞癌是最主要、最常见的病理亚型。多种因素参与宫颈鳞癌的发生发展，其中最重要的是人乳头瘤病毒(HPV)感染。虽然目前针对女性宫颈癌的筛查逐渐普及，宫颈癌疫苗接种范围逐渐扩大，针对宫颈癌患者的治疗方式也多种多样，但是宫颈癌的发病率仍然逐年上升，且晚期宫颈癌患者生存和预后仍不容乐观，多数患者死于转移和复发[1]。因此，探究宫颈癌发生、发展、转移的机制及调控靶点，对了解宫颈癌疾病进展、预防宫颈癌发生、针对性的改善宫颈癌患者预后都十分重要。

miRNA属于非编码RNA，是转录后调节的重要调控子。原癌基因或抑癌基因的3′-UTR端与miRNA能够通过碱基互补配对的方式相互结合，促进mRNA降解、抑制蛋白质的翻译，发挥类似肿瘤促进或抑制因子的作用[10]。近年研究发现，miRNA-451在多种肿瘤中存在异常表达，如胃癌[2]、肝细胞癌[3]、肺癌[4]、乳腺癌[5]，并与肿瘤发生发展及转移有一定关系。miRNA-451定位于17q11.2[11]，可以作为肿瘤诊断和治疗的新的生物标记物。c-myc[6]是myc家族中的成员之一，定位于8q22，是myc家族中被研究得比较多的一个标记物，它在多种肿瘤中存在异常表达，c-myc蛋白表达升高通常提示患者预后不良[12]。WU等[13]发现，c-myc在宫颈鳞癌中呈高表达，且可能促进宫颈鳞癌的侵袭和转移。EMT是肿瘤发生侵袭转移的重要机制，肿瘤细胞上皮表型(如E-cadherin、β-catenin、caludins、occludins)的丢失和间质表型(如Vimentin、N-cadherin、fibronectin)的获得使肿瘤细胞通过细胞外基质迁移迁移到血管、淋巴管中并启动转移级联反应[14-15]。E-cadherin和Vimentin是目前公认的EMT分子标记物。有研究表明，miRNA-451能通过对某些信号通路的调控来影响肿瘤EMT进程，从而影响肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。在肝细胞癌中，miRNA-451通过调节snail y影响EMT表型的获得，具有体外抑癌作用[3]。ZENG等[11]认为，在膀胱癌细胞系中，上调miRNA-451后，N-cadherin和Vimentin显著降低，且细胞增殖、迁移和侵袭能力明显受到抑制，下调miRNA-451表达则得到相反结果，表明miRNA-451可以使膀胱癌细胞保持上皮表型，从而减少肿瘤细胞的侵袭和转移。c-myc是EMT-TFs(Snail、ZEB1、ZEB2)常见的转录因子，能够与这些基因的启动子结合进而调控这些基因的活性[16]。目前研究表明，在结肠癌[17]、恶性黑色素瘤[18]等肿瘤中，c-myc的异常表达都能对EMT产生影响，从而影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。miRNA-451和c-myc均与EMT过程有关，而二者在影响EMT的过程中可能存在着某些相关关系。在乳腺癌中，miRNA-451通过YWHAZ显着抑制c-myc的表达[19]。而在耐多西他赛治疗的肺腺癌中，miRNA-451降低肿瘤细胞增殖、侵袭能力及体内成瘤能力的作用是通过靶向作用于c-myc从而逆转EMT过程来实现的[12]。WANG等[20]的研究进一步表明，膀胱癌细胞中miRNA-451抑制c-myc表达，而敲低c-myc则模仿了miRNA-451的过表达作用，miRNA-451通过直接靶向c-myc抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭。

本文结果显示，miRNA-451在宫颈鳞癌组织中的表达低于CIN和正常宫颈组织，在CIN组织中的表达低于正常宫颈组织，且miRNA-451表达与宫颈鳞癌病理分型及淋巴结转移有关，提示miRNA-451在宫颈鳞癌中低表达，且miRNA-451的表达缺失可能参与宫颈鳞癌的发生发展；c-myc在宫颈鳞癌组织中的表达高于CIN和正常宫颈组织，在CIN组织中的表达高于正常宫颈组织，且c-myc表达与宫颈鳞癌临床分期及患者年龄有关，进一步证实宫颈鳞癌中c-myc表达升高，且参与宫颈鳞癌的发生发展；宫颈鳞癌组织中miRNA-451与E-cadherin表达呈正相关，miRNA-451与Vimentin表达呈负相关，c-myc与E-cadherin表达呈负相关，c-myc与Vimentin表达呈正相关，说明宫颈鳞癌中miRNA-451和c-myc的表达可能均与EMT进程有关；宫颈鳞癌组织中miRNA-451和c-myc表达呈负相关，提示宫颈鳞癌中miRNA-451的丢失可能导致c-myc过表达。

总之，宫颈鳞癌组织中miRNA-451表达降低，c-myc表达升高，均与EMT进程有关，miRNA-451的丢失可能导致c-myc过表达，两者可能参与宫颈鳞癌的发生发展。