CPB期间静脉泵注Dex的大鼠海马CA1区神经细胞凋亡情况、脑皮质组织IL-6表达变化及其机制

张璐，谢玉波，陈燕桦，卢伊芝，何芳，梁蓓薇

广西医科大学第一附属医院，广西南宁 530021

体外循环(CPB)技术常用于临床心内直视手术，它的使用大大降低了心脏手术后患者心肌梗死、心力衰竭等心血管不良事件的发生率及其他心脏原因相关病死率[1]。然而研究[2-3]发现，CPB会对心脏手术患者产生神经损伤，术后患者常出现认知功能障碍、谵妄、中风等现象。右美托咪定(Dex)是一种能高度选择性激动α2肾上腺素能受体的新型药物，具有一定地中枢抗交感、镇静和镇痛作用，临床上常被用做麻醉辅助剂。围手术期间泵注Dex可显著降低CPB心脏手术后患者出现中风和谵妄的概率，且具有脑保护作用[4]。心脏手术患儿CPB期间可导致脑血流自动调节功能受损，海马神经元凋亡及大量炎症因子释放，而Dex应用于心脏手术能减轻神经细胞凋亡和炎症反应[5-6]，但关于其具体机制的研究尚少。Janus激酶2/信号转导子和转录激活子3(JAK2/STAT3)信号通路参与调节脑损伤后细胞存活、细胞增殖、细胞周期进展和血管生成的基因表达[7]，抑制此通路可加速凋亡过程中神经细胞的恢复，减少凋亡细胞的数量，从而降低脑梗死的大小，改善神经功能[8]。2019年9月—2020年3月，我们观察了体外循环(CPB)期间静脉泵注右美托咪定(Dex)的大鼠海马CA1区神经细胞凋亡情况、脑皮质组织IL-6表达变化，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性成年SPF级SD大鼠48只，体质量300～350 g,由广西医科大学实验动物中心提供[SCXK(桂)2016-0054]，所有动物实验操作均在实验动物中心屏障动物实验设施完成[SYXK(桂)2016-0037]。本实验经广西医科大学第一附属医院伦理委员会的批准[2016(KY-E-002)]，并严格按照实验动物使用的3R原则给予人道主义的关怀。

1.2 药物、试剂及仪器 Dex(批号：15011032，江苏恒瑞医药股份有限公司)；IL-6 ELISA试剂盒(美国eBioscience公司)，TUNEL试剂盒(美国Roche公司)，BCA蛋白测定试剂盒(上海双螺旋生物科技有限公司)，兔抗大鼠pJAK2、pSTAT3单克隆抗体(美国Abcam公司)，红外标记的二抗(美国Cell Signaling Technology公司)，Western blot一抗、二抗稀释液(上海碧云天生物科技研究所)；小动物膜式氧合器(东莞科威公司)，体外循环机(德国Stockert公司)，电泳仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3 实验动物分组、Dex给药方法及CPB模型制备 48只大鼠按照随机数字表法分为3组各16只。①Dex组(D组)：在制模前10 min按照5 μg/kg的负荷剂量静脉泵注Dex，后制备CPB模型，即大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)，麻醉成功后将大鼠仰卧固定于操作台上，运用16 G静脉套管针进行经口腔气管插管，设置小动物呼吸机参数(潮气量3 mL/100 g，频率60次/分)，进行机械通气。大鼠右侧颈前区，左右腹股沟区常规剪毛、消毒，后分别行1 cm左右大小切口，用玻璃分针钝性分离出大鼠右颈外静脉，右股静脉和左右股动脉，行左股动脉穿刺并置入24 G静脉套管针，用作监测实时动脉血压、血气变化和全身肝素化处理，左侧股动脉穿刺并置入24 G静脉套管针，用作连接小动物膜式氧合器出血端即CPB灌注端，右颈外静脉穿刺并置入20 G静脉套管针至右心房，右股静脉穿刺并置入22 G静脉套管针，将右颈外静脉、右股静脉联合用作连接小动物膜式氧合器入血端即CPB流出端，转机开始前经左侧股动脉注入肝素钠500 U/kg，若ACT>480 s开始转机，转机开始后，流出端依靠30 cm左右的重力差引流血液至贮血器，通过滚轴泵入氧合器经灌注端回输，灌注量为100～120 mL/(kg·min)，大鼠平均动脉血压维持在75～100 mmHg，整个CPB环路无气泡产生，即模型制备成功。若动物模型制备不成功，则选取同种大鼠重新进行实验。制模后转机2 h，转流期间Dex以5 μg/(kg·h)的泵注速度维持。转机2 h后停CPB。②体外循环组(C组)：建立大鼠CPB模型，模型制备方法参照“①”，制模后转机2 h，转流期间给予与D组等量生理盐水。③假手术组(S组)：只作动静脉血管穿刺置管，不转机，给予与D组等量生理盐水。

1.4 大鼠海马CA1区神经细胞凋亡率测算 采用TUNEL法。各组大鼠于CPB转流2 h结束后立即随机取8只，开胸，分离出心脏，剪开心尖部和右心耳，依次经升主动脉灌注100 mL生理盐水和4 ℃、4%多聚甲醛，颈椎僵硬后立即剪断头部取出脑组织，快速于冰面上分离出海马，放入4 ℃、4%多聚甲醛中固定24 h，常规脱水，石蜡包埋后，制成5 μm厚的冠状切片。参照TUNEL试剂盒步骤进行操作，取石蜡切片，依次经脱蜡复水、蛋白酶消化、染色(TUNEL、DAB、苏木素)、脱水、中性树脂封片后，光镜下观察，凋亡细胞的细胞核呈棕褐色，且可见棕黄色颗粒。每张切片随机选取海马CA1区5个视野，计数凋亡细胞数和总细胞数，神经细胞凋亡率(%)=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.5 大鼠大脑皮质组织匀浆上清液IL-6水平检测 采用ELISA法。CPB转流2 h结束后立即处死各组余下的8只大鼠，剪断头部，取出脑组织，快速的在冰面上分离出海马和皮质，海马组织保存于-80 ℃冰箱中(用于下述实验)，皮质组织用匀浆器充分匀浆，后置于离心机，以3 000 r/min速度离心30 min，吸取上清液，按照ELISA试剂盒说明书步骤检测IL-6。

1.6 大鼠海马组织pJAK2、pSTAT3蛋白检测 Western blot法。取“1.5”已制备并保存于-80 ℃冰箱中的海马组织，加入RIPA裂解液和PMSF，使蛋白在冰上充分裂解40 min，后以12 000 r/min速度离心5 min，弃沉淀留上清液。按照BCA法进行蛋白定量。分别制备12%分离胶和5%浓缩胶，取60 μg蛋白加入上样缓冲液(与蛋白比例1∶4)，100 ℃变性后，点样到SDS-PAGE凝胶中进行电泳，PVDF膜先用纯甲醇浸泡后放入平衡液中，待电泳完毕后，采用半干法使蛋白转移至PVDF膜上，膜用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，TBST漂洗，加入兔抗大鼠pJAK2单克隆抗体(1∶1 000)、兔抗大鼠pSTAT3单克隆抗体(1∶1 000)和兔抗ACTB多克隆抗体(1∶3 000)，4 ℃孵育过夜。TBST漂洗去除未结合的一抗。加入羊抗兔IgG抗体(1∶10 000)，室温孵育2 h。以β-actin为内参，应用Odyssey成像系统扫膜，采用Imaga J软件测定灰度值，以目的条带与内参条带的灰度值比值表示pJAK2、pSTAT3蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组大鼠海马CA1区神经细胞凋亡率比较 D、C、S组神经细胞凋亡率分别为3.93%±0.30%、14.40%±0.18%、3.11%±0.24%，D、S组分别与C组比较，P均<0.05。

2.2 各组大鼠大脑皮质组织匀浆上清液IL-6水平比较 D、C、S组IL-6水平分别为(31.04±0.70)、(47.84±1.33)、(27.99±0.80)pg/100 mg，D、S组分别与C组比较，P均<0.05。

2.3 各组大鼠海马组织pJAK2、pSTAT3蛋白相对表达量比较 海马组织pJAK2、pSTAT3蛋白相对表达量比较见表1。

表1 各组大鼠海马组织pJAK2、pSTAT3蛋白相对表达量比较

3 讨论

CPB对全身灌注的内脏器官产生负面影响，脑损伤是CPB的常见并发症之一[9]。CPB相关脑损伤可能与炎症反应、脑灌注不足、栓塞等病理生理学机制有关，其中炎症反应神经细胞凋亡和在CPB所致脑损伤的发展过程中起重要作用，减轻细胞凋亡和抑制炎症因子释放对CPB期间脑保护有重要意义[10-11]。研究[12]表明，CPB是非生理性灌注，血液成分与非生物材料接触引发炎症反应。

大量动物实验和临床试验均证实，Dex表现出一定地脑保护作用[13-14]。已有研究报道，Dex可缓解大鼠创伤性脑损伤，其机制可能与减少神经细胞凋亡和炎症反应有关[15]。WANG等[16]通过建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，发现Dex使脑缺血梗死面积明显缩小，改善认知记忆功能障碍以及提高脑缺血后存活率。另外研究证实，Dex的使用可减少异丙酚诱导的发育期大鼠海马CA1区凋亡细胞数，降低活化Caspase-3表达，减轻神经毒性[17]。本研究发现，与C组比较，D组大鼠海马CA1区神经细胞凋亡率降低，大脑皮质匀浆上清液IL-6水平降低，提示Dex对大鼠CPB脑损伤有保护作用。

JAK2/STAT3通路是一条细胞内重要的信号转导通路，其可与炎症因子(如白细胞介素)间相互调节。JAK2通过磷酸化被激活，STAT3作为JAK2的下游因子在JAK2激活后发生磷酸化[18]。LI等[19]通过建立大鼠CPB循环模型，发现海马组织pJAK2、pSTAT3表达上调，使用JAK2/STAT3通路特异性拮抗剂能改善CPB大鼠术后认知功能障碍。研究证实，抑制JAK2/STAT3信号通路能减轻脑缺血再灌注损伤所致神经细胞凋亡和炎症反应[20]。本研究发现，与S组比较，C组大鼠海马组织pJAK2、pSTAT3蛋白相对表达量升高；与C组比较，D组海马组织pJAK2、pSTAT3蛋白相对表达量降低；上述结果提示，Dex可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路的激活对CPB大鼠脑损伤发挥保护作用。

总之，CPB期间静脉泵注Dex可减轻大鼠神经细胞凋亡和脑部炎症，机制可能与其可抑制JAK2/STAT3信号通路的激活有关。