鼻咽癌患者血清中长链非编码RNA GAS5的表达变化及其意义

陈正鲁，钟宇南，戴秋芹，陈梓宏，余忠华，罗海清

1广东医科大学附属医院，广东湛江 524001；2广东医科大学

鼻咽癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一，其发病率具有显著的区域性特点。全球范围内以东南亚及我国两广地区最为多见[1]。由于鼻咽腔狭小，组织结构深藏，发病比较隐匿。文献报道，临床上70%鼻咽癌患者确诊时已属中晚期[2-3]。晚期鼻咽癌以系统化治疗为主，患者预后较差。长链非编码RNA(lncRNA)是肿瘤相关的调控因子，调节肿瘤的进展[4]。长链非编码RNA生长停滞特异性转录本5(lncRNA-GAS5)是一种抑癌基因，可抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭转移，促进肿瘤细胞凋亡。lncRNA-GAS5在肝癌、大肠癌、卵巢癌等肿瘤中参与肿瘤细胞的侵袭、转移等调控过程，发挥抑癌作用[5-7]，其异常表达与肿瘤发生发展密切相关。但是目前有关lncRNA-GAS5在鼻咽癌中作用机制的报道较为罕见。我们前期研究[8]显示，lncRNA-GAS5在鼻咽癌组织中呈低表达，其表达水平与临床病理参数密切相关，表明lncRNA-GAS5在鼻咽癌中发挥抑癌基因的作用，但其在鼻咽癌血清学中的研究鲜有报道。2015年3月—2018年12月，我们观察了鼻咽癌患者血清中lncRNA-GAS5的表达变化，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年3月—2018年12月广东医科大学附属医院收治的鼻咽癌患者56例，男36例，女20例；年龄17～72(48.01±6.01)岁，其中<60岁25例，≥60岁31例；TNM分期(2008年中国鼻咽癌分期版本)Ⅰ期11例，Ⅱ期18例，Ⅲ期15例，Ⅳ期12例；淋巴结转移为N0 27例，N1～N3 29例；肿瘤直径<3 cm 35例，≥3 cm 21例；肿瘤分化程度为低分化26例，中分化12例，高分化18例；所有患者均经活检病理确诊，且术前均未接受过任何放化疗治疗、靶向治疗、免疫治疗。另选同期健康体检者42例，男27例，女15例；年龄18～68(45.23±5.68)岁；均无肿瘤史、家族史。本研究患者均知情并签署知情同意书，另经医院医学伦理委员会批准。

1.2 血清lncRNA-GAS5检测 取56例鼻咽癌患者和42例健康体检者清晨外周静脉血各5 mL，全血自凝4 h，后在常温下以3 000 r/min的速度离心10 min，提取上清液，再在4 ℃下以12 000 r/min的速度离心10 min，提取血清，置于-80 ℃冰箱中保存，室温解冻，后在4 ℃下以12 000 r/min速度离心10 min，吸取上清液200 μL，应用miRNeasy Serum/Plasma Kit提取血清总RNA。利用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒(加州福斯特市Applied Biosystems)进行反转录合成第一链cDNA，RT-PCR反应在应用生物系统7900快速实时PCR系统中实现。反应条件：模板预95 ℃、30 s，变性：94 ℃、15 s，退火及扩增：60 ℃、30 s，共反应45个循环。以甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内对照。用比较循环阈值(CT)计算lncRNA-GAS5的表达。

2 结果

2.1 鼻咽癌患者、健康志愿者血清lncRNA-GAS5相对表达量比较 鼻咽癌患者、健康志愿者血清lncRNA-GAS5相对表达量分别为3.69±1.33、7.13±1.93，两者比较，P<0.05。

2.2 血清lncRNA-GAS5表达与鼻咽癌临床病理参数的关系 结果见表1。由表1可知，血清lncRNA-GAS5表达与鼻咽癌TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)。

表1 血清lncRNA-GAS5相对表达量与鼻咽癌临床病理参数的关系

2.3 血清lncRNA-GAS5表达与鼻咽癌患者预后的关系 单因素分析显示，lncRNA-GAS5表达水平[HR(95%CI)为13.792(6.244～30.465)，P<0.05]、肿瘤直径[HR(95%CI)为0.533(0.294～0.967)，P<0.05]、淋巴结转移[HR(95%CI)为0.262(0.134～0.514)，P<0.05]、TNM分期[HR(95%CI)0.102(0.048～0.216)，P<0.05]与鼻咽癌患者预后有关，性别[HR(95%CI)为0.715(0.381～1.343)，P>0.05]、年龄[HR(95%CI)为0.612(0.336～1.114)，P>0.05]、肿瘤分化程度[HR(95%CI)为1.107(0.621～1.971)，P>0.05]与鼻咽癌患者预后无关；多因素分析显示，lncRNA-GAS5的低表达[HR(95%CI)为6.526(2.132～19.980)，P<0.05]、肿瘤直径≥3 cm[HR(95%CI)为0.430(0.230～0.806)，P<0.05]与鼻咽癌患者不良预后有关。

2.4 血清lncRNA-GAS5表达与鼻咽癌患者生存的关系 随访时间截至2019年12月，患者随访时间10～69个月，中位随访时间39个月。Kaplan-Meier结果显示，血清lncRNA-GAS5高表达者(高于lncRNA-GAS5相对表达量的均值,2例)及低表达者(低于lncRNA-GAS5相对表达量的均值，27例)患者总生存期分别为50.3、27.5个月，两者比较，P<0.05。

3 讨论

鼻咽癌是具有明显地域分布特点的头颈部肿瘤，全球以东亚和东南亚地区多见，我国以南部地区流行为主，其是一种发生于鼻咽黏膜的上皮性癌[9]。鼻咽癌主要病理类型包括基底样鳞状上皮癌、角化性鳞状上皮癌和非角化性鳞状上皮癌。非角化性鳞状上皮癌又可分为分化型和未分化型，其中未分化非角化性癌是最常见的病理类型。目前认为，鼻咽癌发生可能与EBV感染、宿主遗传学和环境因素在内的多种因素有关。鼻咽癌早期发病及症状比较隐蔽，大部分患者就诊时已经是中晚期，早期筛查、诊断、治疗是鼻咽癌防治的重要策略之一。

近年大量研究表明，lncRNA与肿瘤的发病机制之间存在着密切关系。据有关文献报道，lncRNA的表达改变与肿瘤的发生、发展和转移密切相关[10]。有研究结果表明，一些lncRNA也可以作为循环lncRNA在全身循环中被检测出来，它们的表达可能与鼻咽癌患者的生理和病理改变直接相关[11]。lncRNA-GAS5为lncRNA分子中的其中一类，其在癌症组织和正常组织中的表达存在差异。lncRNA-GAS5可以通过一些信号通路发挥抑癌作用，其与多种肿瘤有显著的相关性，包括前列腺癌[12]、乳腺癌[13]等，它在这些癌症中可能起抑癌基因的作用。GEE等[14]发现，肿瘤中lncRNA-GAS5呈低表达，提示肿瘤患者预后不良。WANG等[15]发现，食管癌患者血清lncRNA-GAS5表达降低，其高表达通过灭活PI3K/AKT/mTOR途径抑制食管癌细胞的增殖和迁移。研究[16]发现，非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清lncRNA-GAS5中分离出外泌体(Exo-GAS5)，其在非小细胞肺癌中表达降低，表明Exo-GAS5可以作为理想的基于无创血清的标记物，用于识别早期NSCLC患者，间接证明lncRNA-GAS5同样可以用做识别早期NSCLC患者的血清标志物。SHEN等[17]通过对比胶质母细胞瘤患者血清中lncRNA-GAS5的表达情况，发现血清中lncRNA-GAS5低表达的胶质母细胞瘤患者比高表达的胶质母细胞瘤患者生存率差。LI等[18]认为，大肠癌患者血清中lncRNA-GAS5显著下调与细胞因子表达呈负相关，lncRNA-GAS5通过抑制的细胞因子IL-10和血管内皮生长因子来抑制大肠癌的发展。lncRNA-GAS5除了上述的功能外，其还能充当微小RNA(miRNA)的海绵竞争的内源性RNA，从而降低了miRNA的表达[19]。HE等[20]发现，lncRNA-GAS5是微小RNA-21(miR-21)的上游调节因子，它通过抑制部分miR-21调节腹主动脉瘤的形成。因此，lncRNA-GAS5可作为防止腹主动脉瘤形成的潜在靶点。研究[8]显示，lncRNA-GAS5表达与鼻咽癌患者临床病理参数及患者预后相关。

本研究分析了lncRNA-GAS5在鼻咽癌血清中的表达水平与临床病理参数及预后的相关性。目前有关lncRNA-GAS5在鼻咽癌发病机制中的研究极少报道过。众所周知，组织学检查是癌症诊断的金标准，可以通过鼻内镜活检或手术切除获得，但其缺点在于检查有创及价格昂贵，并且具有一定的风险。因此，临床上寻找替代性的诊断技术是有必要的。血液作为生物流体的非侵入性肿瘤生物标记物自然引起了极大的兴趣。本研究显示，鼻咽癌血清lncRNA-GAS5表达低于健康志愿者，lncRNA-GAS5表达与鼻咽癌TNM分期及淋巴结转移相关，这与之前课题组组织样本的研究结果大体一致。另外，lncRNA-GAS5表达下调增强了鼻咽癌的的侵袭性进展。Kaplan-Meier分析显示，血清lncRNA-GAS5高表达患者的总生存期显著高于低表达者，这与Shen等[22]报道的血清lncRNA-GAS5在胶质母细胞瘤的表达结果类似。同时COX回归分析显示，lncRNA-GAS5表达量的高低及肿瘤直径对鼻咽癌患者的预后有较好的预测能力。由此我们可以认为，lncRNA-GAS5可作为鼻咽癌患者生存预后的血清生物学标志。

总之，鼻咽癌患者血清中lncRNA-GAS5表达降低，其表达与鼻咽癌TNM分期、淋巴结转移及患者预后、生存密切相关，此指标可作为鼻咽癌患者新的预后标志物。